一种新型“自我清除”型腺病毒载体的构建与验证研究

腺病毒是组织工程领域中常用的外源基因载体，但其激发宿主免疫和产生复制型腺病毒两个问题至今仍未得到很好的解决。彻底清除已经完成使命的腺病毒，可有效解决这两个问题。为此，我们拟构建"自我清除"型腺病毒载体，具体原理为：结合应用Tet-On诱导表达技术和Cre-LoxP定点敲除技术。将Tet-On系统中的所有元件及Cre-LoxP系统中的Cre酶基因构建到穿梭质粒中,将两个LoxP位点植入骨架质粒中。在组织工程产品移植体内前，加入Dox启动Tet-On，进而诱导Cre酶的表达，Cre酶则切除骨架质粒上两个LoxP位点之间的序列，腺病毒因其关键基因的完整性遭到破坏而降解死亡。然后，我们拟以组织工程中常用的BMP4和VEGF作为外源基因，验证该新型载体的工作效能和降解效率。该项目的实施，有望为组织工程产品提供更安全的外源基因载体；而"使命完成后予以清除"的策略，还可用于其他的病毒载体和基因治疗领域。

腺病毒是组织工程领域中常用的载体，但其激发宿主免疫和产生复制型腺病毒两个问题至今仍未得到很好的解决。清除已经完成使命的腺病毒，可解决这两个问题，为此我们构建了“自我清除”型腺病毒载体。研究内容包括：1）依次将rtetR-VP16序列、连接好的TRE-PminCMV-Cre序列及两个LoxP位点分别插入pShuttle的kpnI、XhoI及PemI和EcoRV位点上，并与骨架质粒共转化BJ5183菌、转染HEK293细胞，制成“自我清除”型腺病毒颗粒；2）构建表达BMP-4、VEGF的“自我清除”型重组腺病毒，感染大鼠骨髓间充质干细胞，分别在48h后及加入诱导剂Dox 24h、48h、72h及120h后计数表达绿色荧光的细胞量，实时定量RT-PCR法检测BMP-4和VEGF mRNA水平，ELISA法检测培养基中BMP-4和VEGF的水平，藉此验证新型腺病毒载体的工作效能与降解效率；3）构建含腺病毒载体的组织工程真皮，诱导腺病毒降解后移植到大鼠皮肤缺损处，1周后以流式细胞仪检测大鼠CD8+ CTL的增殖情况，ELISA检测血中INF-γ的水平。研究工作主要进展和所取得的成果：1）经反复电泳及基因测序证实，成功将AdEasyTM改建成“自我清除”型腺病毒载体，该载体在改建过程中，占用了约2000bp的容量，留下SalI、NotI及HindIII三个酶切位点可用。无诱导剂条件下，Cre酶基因不转录；加入诱导剂Dox后，Cre酶转录、表达，识别并环化切除穿梭质粒中两个Loxp之间的右臂基因组，腺病毒因其基因组的完整性受到破坏而死亡。2）细胞和动物实验证实：新型自我清除型腺病毒载体可像传统腺病毒载体一样装载常用基因，表达强度与传统载体大致相同；加入诱导剂Dox后，新型腺病毒载体可自我清除，5天后装载的BMP-4、VEGF的mRNA和蛋白的表达强度降至诱导前的10%~20%；局部移植不会诱导机体免疫。但是，在构建该新型腺病毒载体的过程中，占用了多个酶切位点，使得新型载体可选的酶切位点剩余不多，也降低了装载能力；另外，该新型腺病毒载体虽然可实现“自我清除”，但需要数天的时间。总的来说，虽然本研究的实用性未能完全达到预定目标，但基本完成了课题的最初设想，具有较高的创新性，可为组织工程产品提供更安全的外源基因载体；而“使命完成后予以清除”的策略，还可用于其他的病毒载体和基因治疗领域。