Fur调控霍乱弧菌生物膜形成和TCP合成的分子机制研究

Fur is a well-charaterized transcription factor responsible for control of iron uptake and homeostasis in Vibrio cholerae. In the present study, V. cholerae Fur is hypothesized to regulate c-di-GMP metabolism, biofilm formation, and TCP (toxin coregulated pili ) biosynthesis to facilitate colonization to host intestine. The phenotypes, including intestinal toxicity, cell toxicity, cell adhesion, intestinal colonization and biofilm formation, of the wild-type V. cholerae, its isogenic fur mutant and the complemented mutant will be characterized, and then RNA-seq-based comparative transcriptomics analysis will be carried out to identify the fur regulon which is composed of a collection of direct Fur targets. Subsequent combined use of Lux reporter fusion, primer extension, gel mobility shift, DNase I footprinting assays will lead to elucidation of the detailed mechanisms of Fur-dependent expression of c-di-GMP metabolism genes vieA, cdgD and VCA0560 as well as virulence-related gene tcpP, which will promote us to gain deeper understanding of regulation of biofilm formation, TCP biosynthesis, and pathogenicity by Fur in Vibrio cholerae.

Fur作为整体调控子，不仅控制霍乱弧菌铁代谢，维持细胞内铁平衡，还可能通过调节环二鸟苷酸（c-di-GMP）代谢、生物膜形成、毒素共调菌毛（toxin coregulated pili, TCP）合成，使霍乱弧菌得以在宿主肠道内定殖并致病。本研究在系统分析野生株、fur突变株、回补株的肠毒性、细胞毒性、细胞黏附能力、肠道定殖能力、生物膜形成等表型的基础上，采用RNA-seq比较转录组分析，鉴定体内感染条件下受Fur直接调控的靶基因，组成Fur调控元。采用Lux报告基因融合实验、引物延伸实验、凝胶阻滞实验、DNase I足迹实验等技术，分析Fur对关键靶基因（c-di-GMP代谢酶基因vieA、cdgD和VCA0560、毒力相关基因tcpP）转录调控的精细分子机制，探究Fur调节生物膜形成和TCP合成的分子机制，更深入的理解Fur在霍乱弧菌致病中的作用。

Fur（ferric uptake regulation）作为整体调控子，不仅控制细菌的铁代谢，维持细胞内的铁平衡，在霍乱弧菌生物膜形成、毒力基因的表达上还有重要作用。密度感应（quorum sensing, QS）是细菌中普遍存在的一种级联信号传导机制，细菌通过合成、分泌并感应信号分子，最终通过激活或抑制其核心调控子的表达来控制细菌生物膜形成和毒力因子表达，从而有利于细菌生存繁殖和致病。. 本研究利用荧光标记测序法取代同位素示踪法，建立了霍乱弧菌转录调控研究的分子生化实验平台。在综合运用生物信息学分析、表型实验和经典分子生化实验技术的基础上，构建了不同生长时段下Fur和QS对霍乱弧菌的生物膜形成、TCP合成、溶血素合成以及甘露醇代谢的调控通路。阐明了霍乱弧菌在环境生存及宿主体内感染的不同时期，Fur和QS核心调控子HapR二者之间的调控关系以及它们对关键靶基因（c-di-GMP代谢酶基因vieA、cdgD、VCA0560，c-di-GMP受体基因vpsT，毒力相关基因tcpP、tcpA，溶血素合成相关基因hlyU、hlyA，甘露醇代谢相关基因mtlA）转录调控的精细分子机制，更深入的理解QS和Fur在霍乱弧菌生存致病中发挥的作用。