抗人载脂蛋白6基因工程抗体用于法医混合检材中精细胞的鉴定与分离

To establish a rapid, simple and efficient method for the identification and isolation of sperm cells from biological samples containing multiple cell types (mixed stain）is an urgent and difficult task in forensic science. This project is based on the theoretical basis that sperm maturation in epididymis requires successive surface modifications, aimed at the specific proteins located on the cell surface or within the sperm cell and utilizing immuno-binding reaction to separate sperm cells from mixed stain samples. Human lipocalin 6 (hLCN6) is an epididymal secreted protein, capable of binding to the head and tail of spermatozoa and associated with sperm maturation. We plan to clone the variable region genes of anti-hLCN6 monoclonal antibody from hybridoma cells. After connecting the genes into the expression vector, we express and purify the recombinant antibody against hLCN6 from the host cells. According to the tag carried by different recombinant antibodies, sperm cells from mixed biological samples can be isolated and purified in a convenient and efficient way by using affinity chromatography or flow cytometry method. Isolated sperm cells can be used for in vitro analysis or directly lysed for the extraction of male specific DNA and genotyping. The study resolves the problems of low specificity and somatic cell contamination existed in the current methods of spermatozoa isolation, which not only provides a new method for the forensic identification and isolation of sperm cells for subsequent individual identification in sexual assault cases, but also opens up new research avenues for the separation of sperm cells from mixed stains based on immuno-binding reaction.

建立一种快速、简单、高效的从含有多种细胞类型的生物样本（混合斑）中鉴定和分离精子的方法是法医学急需解决的难题之一。本项目是基于精子在附睾中的成熟需要持续的表面修饰为理论基础，针对精细胞膜表面或膜内的特异蛋白，利用抗原-抗体反应分离混合斑中的精细胞。人类载脂蛋白6（hLCN6）是一种附睾分泌蛋白，它能结合到精子的头部和尾部，与精子成熟有关。我们从分泌抗hLCN6单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆抗体可变区基因，装入表达载体后，在宿主细胞中表达并纯化重组抗体。根据抗体所带标签不同,采用亲和层析或流式细胞术的方法方便快捷的将混合生物样本中的精细胞分离纯化出来。分离的精子可用于体外检测或直接裂解用于提取男性DNA并进行遗传分型。本研究可解决目前精子分离中的特异性差和体细胞污染等问题，不仅为性侵案件中法医学鉴别并分离精细胞及后续的个体识别提供新方法，而且为依据抗原-抗体反应分离混合斑中的精细胞开辟新途径。

人载脂蛋白6（hLCN6）是附睾特异性分泌蛋白，它能与精子结合，与精子成熟有关。为了探究应用抗hLCN6单克隆抗体偶联免疫磁珠技术分离混合细胞中精子的可行性，建立混合斑中精子分离的新方法，制备了不同比例的精子-上皮细胞混合悬液及混合斑样本，以生物素标记的hLCN6单克隆抗体孵育样品，再用亲和素包被的免疫磁珠捕获分离精子细胞，提取精子DNA进行PCR-STR分型，同时以差异裂解法提取精子，比较两者的差异。经ELISA检测，hLCN6单克隆抗体与抗原的亲和力解离常数为3.47×10–9 mol/L。免疫印迹和免疫荧光结果显示，hLCN6在精子中可检测到，主要定位于精子头部的顶体后区域，但不能在上皮细胞中检测到。hLCN6抗体偶联的免疫磁珠复合物，能够实现精子细胞的捕获和分离。显微镜观察显示免疫磁珠能够与精子头部特异性结合。对精子个数为103/mL的混合悬液，STR分型成功率 (正确分型13个以上，RFU>200) 为90%。当精子数量≥104/mL时，分型成功率达100%；对精子数分别为103、104、105/mL的混合斑STR分型成功率分别为40%、90%和100%。在此基础上，克隆单抗Fab段基因，用噬菌体展示技术筛选阳性克隆并测序。根据测得的可变区序列，构建抗hLCN6 ScFv、BsFv和嵌合抗体Fab片段的原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达纯化，用竞争ELISA法计算亲和力。将亲和力较高的重组抗体构建到真核表达载体中，在哺乳动物细胞HEK293T中表达纯化。将纯化的抗体偶联到磁珠上，与精子-上皮细胞混合液孵育后提取DNA，并进行PCR-STR分型。结果从杂交瘤细胞中克隆到Fd段和κ链的基因，构建的Fab噬菌体抗体库经3轮亲和富集筛选，成功筛选出2株阳性克隆。测序表明两株克隆序列一致。根据其可变区序列构建的3种重组抗体表达质粒在大肠杆菌中成功表达并纯化，亲和力排序为ScFv > 嵌合抗体Fab > BsFv。将真核表达纯化的抗hLCN6 ScFv抗体偶联到不同磁珠上，构建的两种精子捕获复合体均能够实现精子的定向富集与分离，获得单一男性DNA分型结果。综上，首次成功利用抗hLCN6单克隆抗体及其基因工程抗体偶联的免疫磁珠实现了精子分离，该方法简单有效，可作为法医混合斑检验的有效补充手段。