骨钙素诱导椎体软骨终板退变钙化的作用机制研究

Osteocalcin (OCN) is a hormone-like molecule mainly secreted by osteoblasts. Recent findings demonstrated that OCN was an active regulator of energy and glucose metabolism and suggested that OCN can induce calcification. Our previous results showed that the expression of OCN secreted by endplate chondrocytes was related to endochondral ossification and can increase the calcification of chondrocytes. However, how OCN increase degeneration and calcification of cartilage endplate and the mechanism involved is unclear. Our projects first utilize the rat cartilage endplate model to explore the relationship between the OCN and calcification of cartilage endplate by using histology, cytology and molecular biology methods. Then we examine the effect of exogenous OCN and OCN overexpression on endplate chondrocytes metabolism and analyze the involved signaling pathways (Wnt, BMP, etc). Moreover, we use siRNA technique to further discussion the role of OCN in apoptosis and calcification of cartilage endplate in vivo and vitro experiments. In this research, we provide a systematic analysis of regulation mechanism of OCN on cartilage endplate degeneration. This study is a basis for finally elucidate the theory of intervertebral disc degeneration and offer a new thinking and new way for prevention and treatment of disc degeneration related disease.

骨钙素（OCN）主要是成骨细胞分泌的蛋白，研究表明OCN能调控糖脂代谢并能诱导钙化。我们前期工作证实软骨终板细胞在培养过程中有OCN分泌，且OCN能促进软骨细胞钙化，OCN的表达与软骨内骨化过程相关，提示OCN对软骨细胞代谢有重要影响。我们认为OCN参与诱导椎间盘软骨终板退变钙化，但其机制尚不明确。本课题拟采用大鼠软骨终板退变模型，从组织学、细胞学、分子生物学水平上观察OCN表达与软骨终板凋亡钙化相关指标的关系；观察外源性OCN及细胞内OCN过表达对体外培养的软骨终板细胞代谢的影响，并分析可能参与的下游信号传导途径（Wnt，BMP等）；然后通过RNA干扰技术抑制OCN的表达，深入探讨OCN对体内和体外培养的软骨终板细胞凋亡和钙化的影响，系统分析OCN在椎间盘软骨终板退变中的调控机制，为最终阐明椎间盘退变病理机制奠定坚实的理论基础和实验依据, 为椎间盘退变相关疾病的防治开辟新思路与新途径。

骨钙素（OCN）主要是成骨细胞分泌的蛋白，研究表明OCN 能调控糖脂代谢并能诱导钙化。我们前期工作证实软骨终板细胞在培养过程中有OCN 分泌，且OCN 能促进软骨细胞钙化，OCN 的表达与软骨内骨化过程相关，提示OCN 对软骨细胞代谢有重要影响。本课题的主要研究内容、重要结果和关键数据包括：①应用小鼠内胚窦瘤细胞诱导构建软骨终板细胞模型，应用外源性瘦素刺激所诱导的软骨细胞，应用RT-PCR技术以及Western-Blot技术首次揭示证明瘦素可显著提高软骨细胞内骨钙素的表达，并受时间梯度以及浓度梯度影响；并证实骨钙素的表达与ERK通路磷酸化上调有关。②构建由应力失衡诱导的SD大鼠软骨终板退变模型, 通过X线以及H&E、阿利新蓝染色观察所建大鼠模型椎间盘的退变情况。应用Western-Blot以及组织免疫荧光技术检测在终板退变大鼠以及正常大鼠软骨终板中瘦素、骨钙素的表达变化。③提取大鼠软骨终板原代细胞，应用外源性重组大鼠瘦素刺激软骨细胞，发现外源性重组大鼠瘦素可以显著增加骨钙素在mRNA以及蛋白水平上的表达，并呈时间及剂量依赖关系，瘦素刺激大鼠软骨细胞7天后，经茜素红以及冯库萨染色，发现大鼠软骨细胞增值钙化作用明显。④分析瘦素诱导大鼠软骨终板细胞骨钙素表达的信号传导途径，用Western-blot检测NF-kB p-65磷酸化的时间效应。P-p-65在5分钟时开始增强,15-30分钟时磷酸化逐渐加强,至60分钟时恢复至基础水平。统计分析显示15分钟时磷酸化增加了4倍(P<0.05)。对大鼠软骨细胞转染NF-kB p-65小干扰RNA，将磷酸化的P-65沉默，再用瘦素刺激软骨细胞，发现骨钙素较对照组表达减少。⑤进一步探讨瘦素诱导骨钙素OCN表达增高与NF-kB信号通路之间的关系，在基因水平上检测OCN与NF-kB的关系。首先用基因软件预测OCN启动子与NF-kB的结合位点，5,RACE验证OCN的启动位点，应用双荧光素酶进一步验证OCN启动子与NF-kB的结合位点。免疫共沉淀检测内源性NF-kB与OCN的结合情况。本课题深入探讨OCN 对体内和体外培养的软骨终板细胞凋亡和钙化的影响，系统分析OCN 在椎间盘软骨终板退变中的调控机制，为最终阐明椎间盘退变病理机制奠定坚实的理论基础和实验依据, 为椎间盘退变相关疾病的防治开辟新思路与新途径。