蓬松状三维纳米纤维支架诱导原代肝细胞聚集体形成研究

肝细胞聚集体是最具应用潜力的肝细胞源，在药代动力学分析、肝细胞治疗等基础研究领域发挥着重要作用。但现有肝细胞聚集体诱导技术存在效率低、产量小、内部细胞易死亡等缺点，严重制约了现代生物医学的发展。本课题提出利用蓬松状三维纳米纤维支架诱导原代肝细胞聚集体形成的新方法，旨在解决现有技术存在的缺陷，为肝细胞基础研究提供丰富、稳定的肝细胞源。首先，利用静电纺丝技术制备蓬松状三维纳米纤维支架，实现细胞的三维立体培养。然后，借助支架内单分散纳米纤维和半乳糖残基的协同效应快速、大量地诱导肝细胞聚集体的形成。最后，通过单分散纳米纤维的物理效应将聚集体尺寸控制在60-90微米范围内，避免聚集体过大导致内部细胞死亡的现象。最终，获得能够在长期培养过程中保持高水平细胞活性和肝功能表达的肝细胞聚集体。

本项目采用静电纺丝技术通过电场优化和改变接受介质的方式首次实现了蓬松状电纺纳米纤维支架的制备。该支架内的纳米纤维呈单分散状态，纤维与纤维之间的空间距离在50-100微米。利用该支架实现了原代肝脏细胞的体外高密度三维立体静态培养，细胞密度可达5×107cells/cm3。在长时期（7天）的培养过程中，原代肝脏细胞在该培养体系内展现出优良黏附生长行为和细胞活性（>80%）；通过上述开发的电纺技术，本项目分别利用半乳糖接枝的壳聚糖和聚乳酸乙醇酸聚合物为基材制备出功能化的蓬松状三维单分散纳米纤维支架。利用半乳糖基团与原代肝脏细胞膜表面蛋白受体的相互作用以及支架单分散的纳米纤维对肝脏细胞迁移行为的束缚作用，成功诱导了原代肝脏细胞聚集体的形成。聚集体的直径在60-90微米的范围之内，且表现出优良的生物活性，以及高水平的肝功能水平（培养7天后，白蛋白分泌水平为55μg/106cell/day, 尿素的代谢量为23 μg/106cell/90min），这些结果是目前原代肝脏细胞体外培养的最高水平；此外，本研究还进一步研究了纳米纤维的表面微观形貌对肝细胞培养的影响，结果显示纳米多孔的纤维表面形貌有助于肝脏细胞的活性保持，这一结论为新型肝细胞培养基质的设计提供了重要的理论依据。通过本项目的实施，成功建立了一种新型的原代肝脏细胞聚集体诱导技术，可实现具有高活性和功能水平的肝细胞聚集体的快速形成，为解决临床医疗特别是生物人工肝以及基础研究如药物筛选等领域亟需高质量肝细胞源的困境提供了有效途径。