miR-10a*在B组3型柯萨奇病毒感染中的作用

miRNA是内源性非编码小RNA，可转录后调控基因表达。CVB3是单股正链RNA病毒，可致严重疾病。我们前期研究发现miR-10a*上调CVB3基因复制及其在CVB3基因组上的靶点位置；证实miR-10*可增强CVB3在小鼠原代心肌细胞的感染，但前期体外实验的证据不足以阐明内源性miR-10a*在机体感染CVB3过程中的生物学功能。本研究拟通过建立miR-10a基因敲除小鼠模型，筛选出miR-10a-/- 、miR-10a+/-小鼠，分析其表型差异，推测pre-miR-10a在小鼠生长发育中的作用。分别通过体内及体外实验，检测CVB3感染的不同龄敲除小鼠心肌中病毒复制水平以及病理损伤的情况，同时利用我们前期构建的能够表达miR-10a*的腺病毒系统，过表达miR-10a*，逆转上述过程，从而揭示miR-10a*在CVB3致心肌疾病中的生物学意义，为治疗CVB3引起的心肌病提供新的靶点。

柯萨奇病毒感染人体可引起急性或慢性心肌炎，少数病人可表现为进行性心衰、心律失常或猝死。miRNAs是细胞基因表达的转录后调控机制，在心脏发育、心肌重构、心力衰竭和心律失常等发生和发展中有重要作用，对多种病毒的感染也具有调控作用。本研究首次发现宿主的miRNA（miR-10a*）能促进CVB3在细胞中的复制作用。在HeLa细胞中，人工合成miR-10a*进行过表达，可以促进CVB3表达。然后我们通过预测软件分析CVB3基因组中miR-10a*的靶位点，并构建可能靶点突变CVB3毒株，检测miR-10a*对突变株的作用，从而确定miR-10a*的靶点位于CVB3基因组的nt6918 - nt6941（CVB3 3D编码区）。应用软件比对不同型别的CVB基因组该区域的序列，发现具有高度同源性，推测miR-10a*对其他型别的CVB的复制可能也具有上调作用。为了确定miR-10a*在CVB3致心肌病中的生物学作用，我们构建了表达miR-10a*的腺病毒载体，发现Ad-miR-10a*可以促进CVB3的复制水平。由于乳鼠心脏组织中miR-10a*的表达量高于成年小鼠，利用我们构建的靶点突变CVB3株感染乳鼠后发现，突变株的表达水平明显低于野生株，进一步证明miR-10a*在体内是通过转录后调控的机制促进野生型CVB3的蛋白合成，而作用的机制是miR-10a*直接与CVB3 3D编码区结合，促进CVB3在心脏的感染。我们在研究miR-10a*对CVB3的作用时发现miR-342-5p对CVB3的合成有抑制作用。并且此抑制作用是通过与位于CVB3 2C的靶点结合产生的。感染CVB3的乳鼠除了心脏组织miRNA有改变外，我们通过外周血miRNA表达谱芯片的检测，发现CVB3还可以影响血液中miRNA的变化，提示我们血液miRNA可能成为CVB3引起心肌病的诊断指标。在研究miRNA对CVB3作用的同时，我们还对长度在200nt以上的长链非编码RNA（ lncRNA）与CVB3的关系进行了研究，发现CVB3可以改变HeLa细胞中lncRNA及mRNA的表达谱，提示CVB3可能通过影响lncRNA及其相关基因的表达致细胞病变。综上，宿主心脏组织以及血液中的非编码RNA都可以对CVB3的感染产生影响，从而促进或抑制疾病的发生。这可能是CVB3致心肌病的重要机制之一，也可能成治疗的新靶点。