PA-MSHA诱导干扰肺腺癌细胞Wnt/β-catenin和EGFR交叉通路与逆转EGFR-TKI耐药的相关性研究

PA-MSHA, a genetically engineered Pseudomonas aeruginosa (PA) strain, expressing mannose-sensitive hemagglutinin (MSHA) on its surface, has been used as a protective vaccine. Recently, PA-MSHA has been recognized to be able to induce apoptosis and inhibit EGFR signaling pathway in different human cancer cells. However, the direct cytotoxic mechanism of cancer death mediated by PA-MSHA remains unknown. In our study, PA-MSHA was administered to lung cancer cells. Morphological and molecular results indicated that interference of Wnt/β-catenin and EGFR signal pathway cross-talk was induced by PA-MSHA. Furthermore, PA-MSHA was proved to be able to inhibit the Wnt/β-catenin signal pathway and induce apoptosis. Thus, we hypothesis that PA-MSHA may reverse the EGFR-TKI resistance through a mechanism of inducing apoptosis via inhibition of Wnt/β-catenin and EGFR signal pathway cross-talk. In this subsequent study, we set out to identify more therapeutic targets and clarify the detailed mechanisms, such as the relationship with Wnt/β-catenin signal pathway and EGFR signal pathway, of the anti-proliferative effect of PA-MSHA on lung cancer cells both in vitro and in vivo. Flow cytometry, western immonoblot, RNA interference, electron microscopy will be used in our study. The combination of EGFR-TKIs and PA-MSHA has potential benefit in EGFR-TKIs resistant lung cancer patients.

铜绿假单胞菌甘露糖敏感血凝菌毛株(PA-MSHA)是我国自主产权的表达甘露糖敏感血凝菌毛的菌苗，对其细胞毒性作用机制尚不清楚。申请人首次发现了PA-MSHA 能诱导肺腺癌细胞凋亡，阻断EGFR 受体通路活化，通过进一步研究发现干扰Wnt/β-catenin和EGFR交叉通路也参与了PA-MSHA 作用机制，抑制Wnt/β-catenin通路能诱导凋亡。为此我们提出假设，通过抑制Wnt/β-catenin通路进而交互抑制EGFR通路，提高PA-MSHA 诱导凋亡作用从而逆转EGFR-TKI耐药。为验证此假说，本研究拟用分子标记、免疫印记、RNA 干扰和显微显像等分子生物学技术，通过体外和体内途径，揭示Wnt/β-catenin通路与EGFR通路交互抑制参与了PA-MSHA 对肺腺癌细胞分子调控机制以及它们之间的相关性，从而为肺腺癌尤其是EGFR-TKI耐药患者治疗提供新途径。

项目的背景：PA-MSHA是基因工程改造的铜绿假单胞菌菌株，目前研究显示PA-MSHA可以诱导肿瘤细胞凋亡，这些现象主要是在乳腺癌被发现。PA-MSHA对于肺癌的抗肿瘤机制需深入研究。.主要研究内容：本研究从免疫印迹实验，细胞增殖试验和小鼠移植瘤模型等研究PA-MSHA在EGFR-TKI敏感、EGFR-TKI耐药的肺腺癌细胞中的抗肿瘤作用以及其联合EGFR-TKI在EGFR通路与Wnt/β-catenin通路交互抑制参与了PA-MSHA 对肺腺癌细胞分子调控机制，从而为肺腺癌EGFR-TKI耐药患者治疗提供新途径。.重要结果：在研究PA-MSHA的交互抑制作用中，我们成功打通了EGFR通路，证实了PA-MSHA对于肺腺癌尤其是EGFR-TKI耐药细胞的抗肿瘤作用，明确了其机制，并且研究发现了联合EGFR-TKI具有协同作用，在EGFR-TKI耐药细胞中尤为明显，在体外细胞实验和体内动物实验中都得到了验证。.关键数据：1.对于PC-9，A549，NCI-H1975细胞，通过FCM发现不同浓度的PA-MSHA诱导肺癌细胞凋亡和细胞周期停滞。PA-MSHA治疗可以通过影响细胞周期和诱导内源性凋亡，从而对NSCLC发生抗增殖作用。数据表明PA-MSHA单药就已经具有抑制NSCLC增殖和诱导凋亡的潜力。.2.PA-MSHA加吉非替尼表现出了时间和浓度依赖性细胞毒性作用，在PC-9，A549，NCI-H1975细胞中观察到随PA-MSHA浓度增高，吉非替尼浓度不变情况下，具有递增的抑制肿瘤细胞增殖作用。在细胞周期研究中，发现sub-G1含量明显增高，S期细胞含量减少。PA-MSHA加吉非替尼比较单药PA-MSHA具有更强的诱导凋亡作用。此外，通过WESTERN blot检测出PA-MSHA导致切割型caspase-3 / caspase-9蛋白表达增高，揭示了诱导的凋亡的内源性机制。PA-MSHA增加对EGFR依赖性AKT和ERK磷酸化活化的抑制，揭示了PA-MSHA的抗肿瘤机制。PA-MSHA联合吉非替尼在减少肿瘤大小和抑制EGFR活化作用方面更有效。.科学意义：在体外和体内实验证实了PA-MSHA对于肺腺癌的抗肿瘤作用，揭示了其中的机制是诱导凋亡和抑制EGFR通路的活化，PA-MSHA联合吉非替尼对于肺腺癌有协同的抗肿瘤作用，对于EGFR-TKI耐药细胞仍有作用，值得临床进