△F508突变延迟CFTR磷酸化激活反应的分子机制探讨

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a PKA-activated chloride channel, regulating transepithelial ion movement, water absorption and secretion. Dysfunction of CFTR by genetic mutations causes an inherited disease cystic fibrosis (CF). Almost 80% of patients with CF carries a mutation ΔF508. This most common mutation reduces both CFTR activity and protein processing and expression. Our recent study demonstrates that the activation of ΔF508-CFTR by PKA phosphorylation is markedly delayed. To understand the underlying mechanisms of this important defect, our preliminary results have demonstrated that the R domain, phosphorylated by PKA, controls CFTR activation by regional inhibitory or stimulatory effects in specific locations. Thus, this project will use R domain mutants to alter the regulation of CFTR activation by PKA phosphorylation. By this approach, we will investigate the molecular mechanisms how ΔF508 causes the delay in channel activation. Moreover, we will investigate whether CFTR phosphorylation is associated with the reduction of channel activity and protein processing, caused by ΔF508. This study may let us understand better in CF pathogenesis, leading to the development of new drugs and treatments.

CFTR是一个由PKA激活的氯离子通道，调节表皮细胞离子运输、水分吸收和分泌。基因突变造成CFTR功能缺失，会导致一种遗传疾病 - 囊性纤维化(cystic fibrosis, CF)。将近80%的CF患者带有ΔF508突变。这个最常见的突变造成CFTR活性下降及蛋白质传递和表达减少。我们近来研究发现：ΔF508-CFTR受到PKA磷酸化激活的反应有显著延迟现象。为了解这一重要缺陷的发生机制，我们初步结果已发现在CFTR结构中，被PKA磷酸化的regulatory (R) domain是借由特定区域的抑制或兴奋作用来调控CFTR活化。因此，本课题将用R domain突变株改变PKA磷酸化对CFTR活化的调控，借此探讨ΔF508造成活化延迟的分子机制。并探讨CFTR磷酸化是否与ΔF508造成的活性下降和表达减少有关。本课题将使我们深入了解CF疾病的基本病理机制，有助于开发新的药物和治疗方法。

本研究的主要意义在于了解一种遗传性疾病的致病机制。此疾病称为cystic fibrosis（囊性纤维化），简称CF。CF 的发病机理是一个上皮细胞的氯离子通道发生遗传性基因突变而导致其生理功能的丧失。这个氯离子通道称为cystic fibrosis transmembrane conductance regulator（简称CFTR）。在了解基因突变如何造成CFTR功能丧失的研究中，ΔF508缺失突变最受到重视，因为将近 90% 的CF病人都带有此突变基因。本研究探讨CFTR磷酸化活化是否与△F508缺失突变造成功能缺陷如传递缺陷及通道门控缺陷有关。我门利用膜片钳，蛋白质电泳和分子生物技术来进行本研究。第一，我门发现CFTR的R domain结构藉由二种抑制作用来控制通道的活化。PKA磷酸化可解除抑制作用达到活化CFTR的目的。此发现是非常重要的，因为由此我门可以找出直接活化CFTR 的方法。第二，我门发现ΔF508突变不会影响CFTR intraburst gating kinetics。然而磷酸化R domain可调节其中开放及短时间关闭的长短。此发现对CFTR 的通道调控有更深一层的了解。第三，我门发现在残基F508旁的loop结构，其异常是造成ΔF508突变产生CFTR功能缺陷缺的主因之一。此发现是非常重要的，因为由此我门可以藉由药物来解决此异常，乃治疗 cystic fibrosis （囊性纤维化）的突破性发现。本课题研究结果对PKA磷酸化及ΔF508突变产生CFTR功能缺陷缺之间关系有更深入了解，有助寻找更好的方法来治疗囊性纤维化疾病。.