氧化还原酶参与的新型半纤维素降解模式研究

The degradation of lignocellulose is always considered as the synergistic actions of serial hydrolases. However, according to recent studies, oxidoreductases are also identified as a pivotal role in hydrolyzing cellulose. And it is a question whether there are also some oxidoreductases in the degradation system of hemicellulose? Previously, a new hemicellulose degradation gene cluster encoding two oxidoreductases is obtained from Thermoanaerobacterium bryantii, which could degrade hemicellulose efficiently, and amino acid sequences of these two oxidoreductases show very low similarities (<21%) with all characterized oxidoreductases. This gene cluster is a ideal model to study the new degradation system of hemicellulose. The present project will focus on the systematic investigation of characteristics of hemicellulases and oxidoreductases, particularly the catalytic function, reaction mechanism and structure-function information of oxidoreductases. The synergistic actions of these enzymes in degrading hemicellulose by microbes will be investigated both in vivo and vitro, especially synergistic functions of oxidoreductases. This work will firstly reveal the new hemicellulose degradation system with oxidoreductases and enrich the oxidative degradation system of plant cell wall’s polysaccharides. It will also promote the industrial use of this new efficient enzymes cocktail with excellent ability on hydrolyzing hemicellulose.

一直以来，木质纤维素的降解被认为是一系列水解酶协同作用的结果，但是最新的研究确证了氧化还原酶在纤维素降解中具有举足轻重的作用。然而，在半纤维素降解中是否也存在这种氧化还原酶参与的降解模式却还是一个有待解决的问题。在前期研究中，我们从半纤维素降解菌普雷沃氏热厌氧杆菌中发现了一个新型半纤维素降解基因簇，其中含有的两个氧化还原酶其蛋白序列相似度与已知的氧化酶低于21%。该基因簇是研究半纤维素降解新模式的理想模型。本项目将系统研究基因簇中氧化还原酶和半纤维素酶的酶学性质，特别是新型氧化还原酶的催化功能、反应机理和结构功能关系；研究这些酶在微生物体内及体外降解半纤维素的协同作用，特别是氧化还原酶的协同机理。本项目将首次揭示氧化还原酶参与的新型半纤维素降解模式，进一步完善植物细胞壁多聚糖的氧化降解体系，同时也将推动这类新型高效复合酶体系在半纤维素降解中的实际应用。

前期寻找到包含氧化还原酶（TbHEOA和TbHEOB）的半纤维素降解基因簇，该基因簇还包含木聚糖酶TbXyn10A、木糖苷酶组（TbXyl39A和TbXyl52A）、α-葡萄糖醛酸酶TbAgu67A和乙酰木聚糖酯酶TbAxe1A。通过三年的项目执行，我们成功实现了基因簇所有酶蛋白高效可溶表达，并获得高纯度酶蛋白。分析了基因簇上半纤维素水解酶的催化功能和酶学性质，发现所有酶蛋白的最适反应温度都在65°C -70°C左右，是典型的耐热酶，便于耐热复合酶体系的构建。详细比较了两个木糖苷酶的酶学差异，发现它们在催化功能、降解方式、重金属离子辅因子等方面，具有很明显的互补差异性。分析了基因簇水解酶的协同互补行，最终构建了针对不同木聚糖来源的高效复合水解酶降解体系。进行了氧化还原酶的辅因子筛选，发现氧化还原酶TbHEOA和NADH有很强的结合作用，另外它和NAD+以及NADPH也有微弱的结合作用；其它检测的重金属离子和还原小分子均未检测到和两个氧化还原酶有明显结合作用。然后在辅因子NADH的协助下，筛选了氧化还原酶可能的可溶底物寡糖，检测了它们对水解酶降解不同来源半纤维素的促进作用，均未能确认它们的催化活性，未能发现它们的底物和产物。但研究发现，辅因子NADH和Mn2+能显著提高含氧化还原酶复合酶体系降解半纤维素的能力，进一步研究证实Mn2+能微弱促进木糖苷酶TbXyl52A活性，而NADH除了可能是氧化还原酶的辅因子，还能显著促进木糖苷酶TbXyl39A的活性。因此可以推测，NADH在这个含氧化还原酶基因簇降解半纤维素过程中起着很关键的桥梁作用。同时从富含半纤维素降解微生物的自然环境-浓香酒曲中寻找到大量新颖的多聚糖单加氧酶基因，从中也在寻找可能的半纤维素氧化还原酶。本项目首次研究氧化还原酶参与的新型半纤维素降解模式，揭示了其中起重要作用的辅因子NADH，同时本项目构建的半纤维素复合水解酶体系将进一步推动半纤维素的高效降解与利用。