乙醛酸途径在大豆根系吸收与代谢甲醛中的作用研究

In a plant-microbial complex system for purification of formaldehyde (HCHO) pollution, plant roots make an important contribution to HCHO removal. The preliminary studies of this project showed that soybean roots could efficiently assimilate HCHO from the HCHO solutions. The glyoxylate pathway might play an important role during HCHO metabolism in roots. Using soybean roots as the experimental materials, this project will further clarify the role of glyoxylate pathway in HCHO metabolism by soybean roots through 13C-NMR analysis. The expression and enzyme activity of the key enzymes, isocitrate lyase (ICL) and malate synthase (MS), in glyoxylate payway in soybean roots will be altered by physiological and biochemical methods. Changes in root HCHO uptake and metabolism will be analyzed to determine whether the glyoxylate cycle is a major pathway for HCHO metabolism in liquid HCHO-treated soybean roots and its role in HCHO uptake by roots. The expression and enzyme activity of ICL and MS will be reduced by RNAi technology in transgenic soybean roots. The contribution and function of the glyoxylate cycle will be verified by investigation of changes in HCHO uptake and metabolism by transgenic soybean roots under liquid HCHO stress. The results will help us to further understand the metabolic mechanism of plants to response to HCHO stress. The evidence obtained from the results will provide the theoretical basis for development of more phytoremediation technology of HCHO pollution and also provide the novel strategy as well as gene resources for genetic engineering to improve the HCHO uptake- and metabolism-ability of transgenic plants.

本项目前期研究发现大豆根系能从甲醛溶液中有效吸收甲醛，乙醛酸途径在大豆根甲醛代谢过程中可能发挥重要作用。本项目将以大豆根系为材料，用13C-NMR方法进一步解析乙醛酸途径在大豆根系甲醛代谢和脱毒过程中的作用；通过生理生化方法改变乙醛酸途径关键酶异柠檬酸裂解酶(ICL)和苹果酸合成酶(MS)的表达水平和酶活性，分析大豆根系甲醛吸收和代谢能力的变化，确定乙醛酸循环是否为大豆根系在液体甲醛胁迫下根细胞内的主要甲醛代谢途径及其在甲醛吸收中的作用；用RNAi干扰产生ICL和MS表达显著降低的转基因大豆，分析在液体甲醛胁迫下转基因大豆根系甲醛吸收和代谢能力的变化，验证乙醛酸途径在大豆根系甲醛和代谢过程中发挥的作用。研究结果将使我们能好地了解植物根系应答甲醛胁迫的代谢机理，为开发更多甲醛污染的植物修复技术提供理论依据，为利用基因工程提高植物甲醛吸收和净化能力提供新的操作策略和基因资源。

丹波黑大豆RB和云南小黑豆SB根系都能有效吸收液体甲醛，两者吸收甲醛的动力学相似，先慢后快，呈幂函数模型。比较两种黑豆根部和叶部甲醛吸收与代谢产物，SB根中Pro含量要高于RB，而叶部低于SB，说明SB根系对甲醛胁迫耐受能力强于RB。13C-NMR分析发现两种植物对甲醛代谢具有相同的代谢途径，其差别主要体现在代谢时间进程，SB迟于RB。渗透性转运孔抑制剂（CSA）能抑制线粒体和乙醛酸循环体功能，一定程度影响黑大豆对甲醛的吸收。乙醛酸循环的中间代谢产物柠檬酸等能抑制植物对甲醛的吸收，而苹果酸等能促进SB植株甲醛吸收。抗氧化剂ASA和GSH能显著提高SB植株甲醛吸收。.RT-PCR分析表明ICL及MS基因在2mM低浓度甲醛处理24h，高浓度（4、6mM）甲醛处理2h呈上调， qRT-PCR分析表明2mM甲醛处理24h表达量比对照分别提高2倍和3.4倍， 4mM处理2h分别提高5.3和1.6倍，表明ICL和MS的表达受甲醛胁迫诱导。用ICL和MS表达的抑制剂和激活剂分别和甲醛共处理SB根，其ICL和MS的表达量和酶活均显著下降，用激活剂甲醇处理时ICL和MS基因的表达量和酶活性显著上升。13C-NMR分析表明抑制剂甘露糖导致通过乙醛酸循环产生的代谢产物苹果酸、柠檬酸、葡萄糖量减少；激活剂甲醇使柠檬酸和葡萄糖产量显著增加。这些结果证实乙醛酸循环在SB根系甲醛代谢中起到重要作用。.用ICL和MS基因的RNAi干扰表达载体通过根癌农杆菌转化黑大豆的子叶和下胚轴实验失败，同时通过发根农杆菌转化黑大豆的子叶产生毛状根也没有成功。13C-NMR分析甲醛处理能进行转基因大豆威廉姆斯的根系，结果表明乙醛酸途径不参与其根系的甲醛代谢，因此不能用威廉姆斯产生转基因植株研究乙醛酸途径在甲醛代谢中的作用。.能进行转基因操作的水稻品种日本晴根系的甲醛代谢产物分析表明乙醛酸途径参与日本晴甲醛代谢。我们用基因编辑技术获得日本晴3个ICL纯合突变体和9个MS纯合突变体。繁殖了一批纯合突变体种子，为下一步研究乙醛酸途径在甲醛吸收代谢机理提供材料。