ABI5家族保守区II的转录激活活性的分子机理研究

ABI5 (AtDPBFs/ABFs)家族是一类亮氨酸拉链型转录因子。它们参与了植物种子胚胎发育晚期的基因表达调控以及ABA信号的传导。在拟南芥中，ABI5家族至少有八个成员。对这八个成员进行序列对位排列时发现了七个保守区域。保守区I、III、IV、VII的序列与一些激酶如CaMKII/PKC/PKG和CKII的磷酸化位点一致。保守区VI含有结合DNA的碱性区和单体聚合为二聚体的亮氨酸拉链区。保守区II和V的功能未知。项目申请者的先期研究表明，ABI5家族的保守区II可独立激活转录并受潜在磷酸化位点区域的负调控。保守区II作为转录激活域和已报道转录激活域没有氨基酸序列上的同源性。因此，在分子水平上对ABI5家族的保守区II激活转录的分子途径与接受调控的方式进行详细分析，有助于我们深入了解基因表达调控的机制以及种子胚胎发育晚期的信号传导过程。本研究对培育抗旱转基因作物也具有重要的理论指导意义

克隆、表达、纯化了ABI5家族abi5/AtDPBF1、EEL/AtDPBF4以及TMAC2（ABI5的相互作用蛋白）等基因。构建了与酵母双杂交系统配套的植物瞬间表达分析系统。亚克隆了ABI5家族保守区II和保守区I-II-III片段（来自EEL/AtDPBF4）于酵母单杂交系统和植物瞬间表达分析系统。验证了保守区II在拟南芥原生质体中激活转录的活性以及保守区I和III对这一活性的抑制效应。对保守区II进行了一系列定位与缺失突变分析。结果表明，短至8个氨基酸残基、预测构象为α-螺旋的片段（LDELLKTV）仍然能够在酵母细胞中激活转录。而该段序列的氨基端片段和羧基端片段均无转录激活活性。虽然如此，上述α-螺旋周围的保守氨基酸残基发生突变时仍然会影响到保守区II的转录激活活性。保守区II的定位突变分析工作还发现了一些有趣的现象：定位突变（4IIK39E、4IIK51R、4IIK39,51R、4IIK39E/K51R、4IIL50P）可抑制酵母菌生长，α-螺旋羧基端缺失（4II38-53aa）的质粒得不到转化酵母菌。对酵母和拟南芥原生质体的蛋白提取物进行了免疫共沉降分析。SDS-PAGE分析表明，Gal4的DNA结合域和DPBF4的保守区II构成的融合蛋白组（Gal4-DBD-CRII）与对照组（仅Gal4-DBD）没有出现差异条带，即未能分离到与保守区II相互作用的蛋白质分子。本项目对保守区II在植物细胞中转录激活活性的验证、保守区I和III对保守区II活性的抑制作用、缺失突变确定的具转录激活活性的8氨基酸残基肽段、以及可抑制酵母生长的保守区II突变体等研究结果均未见国内外报道。这些研究结果推进了对保守区II如何激活转录以及如何受控调节的认识。