可实现人源血小板活细胞丝状肌动蛋白超分辨成像的小分子荧光探针构建及应用

The platelet plays an important role in hemostasis, metastatic spread of cancers and other physiological process. utrastructure of platelets can be a sensitive indicator of physiological conditions of platelets. Traditional ultrastructure research mainly relies on electron microscopy, which could not be applied in living cells. Super-resolution fluorescence microscopy has been developed for ultrastructure imaging of living cells. However, since human platelets are unable to express exogenous gene and fluorescent markers can also not be able to penetrate into living platelet cells themselves, it is not available now to accomplish super-resolution imaging in both “living” and “human derived” platelet cells. Based on the cell penetrating peptides we have designed, this project aims to design and synthesize a series of novel fluorescent probes for super-resolution imaging, which can directly penetrate into “living” and “human derived” platelet cells and target F-actin in the cytosolic. Then, evaluated by targeting ability, penetrating efficacy, biocompatibility and spatial resolution of imaging, the optimum probe will be picked out. Using this optimum probe, this project will accomplish super-resolution images of F-actin in living and human derived platelet cells and monitor the dynamic behaviors of F-actin under physiological conditions. And with this optimum probe, platelets from patients with idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) will be explored for the discriminating ultrastructure and dynamic characteristics of F-actin, which will make the ultrastructural diagnosis to be possible for ITP patients.

血小板是人体凝血，肿瘤转移等生理病理过程的重要功能单位。细胞骨架超微结构是反应血小板生理状态的敏感指标。传统的超微结构研究手段电子显微镜无法观察活细胞状态。超分辨荧光显微成像是一种适合活细胞的成像手段。然而由于人源血小板无法表达外源基因，化学荧光标记物也无法自主进入血小板活细胞，目前血小板超分辨成像始终无法兼顾“人源”和“活细胞”两个条件。本项目将基于申请者设计的混合D-Arg细胞穿膜肽，设计合成一类能够直接进入人源血小板活细胞胞质内标记丝状肌动蛋白的超分辨荧光探针，并从靶向能力、标记效率、生物相容性及超分辨成像空间分辨率4个角度，筛选出最优超分辨探针。基于该探针，本项目将在国际上首次实现“人源血小板活细胞”的丝状肌动蛋白超分辨成像，并记录其重组动力学。并应用该探针探索原发性血小板减少性紫癜（ITP）患者血小板超微结构及其动力学变化特征，为实现ITP超微结构诊断提供理论依据。

血小板是人体一类特殊而又功能负责的无核细胞，是人体止血、血栓形成、癌症转移等生理病理过程的主要功能单位。细胞骨架是血小板执行各项生理功能的结构基础。微观上，血小板骨架的超微结构变化已被证实与癌症、炎症等多种疾病相关。目前对于血小板细胞骨架的研究都是限于单个细胞内的变化。公认的血小板微管骨架激活模型是：血小板静息时微管骨架呈现Marginal Band大圆环结构；激活后圆环皱缩形成一个更小的圆环。而宏观上，血小板数量意义重大，血小板较低时会引发人体凝血障碍等症状。研究证实血小板密度会影响激活血小板激活的聚集速度以及胞内稳定钙离子流。宏观的血小板数量是否会影响血小板胞内骨架的微观变化是一个未知的问题。 .基于人源血小板活细胞的微管骨架的超分辨成像（dSTORM和SIM），我们发现了一种新的与密度相关的血小板激活后微管骨架重组模式，展示了一种新的微管骨架结构。我们证明，在低细胞密度下，血小板微管骨架变化符合传统的骨架重组模式；而在在接近人体内真实的高细胞密度下该模型不再适用，激活血小板的微管骨架稳定呈现为一种花状结构。我们也通过电镜佐证了该新型结构的存在。通过实时活细胞成像，我们展现了这种新机构在血小板内形成的动态过程，并且验证了不同胞内马达蛋白对该结构形成的影响。抑制微管动力蛋白kinesin和dynein不会影响该结构的形成；而微丝动力蛋白myosin则决定了该结构的出现。有趣的是，抑制myosin只会影响高密度血小板激活骨架模型，而不会影响低密度的单个细胞内的微管骨架变化。微管蛋白是一种进化保守的蛋白，其复杂的功能往往通过表达后修饰来实现。我们进一步展示了蛋白表达后修饰在这种新结构形成中的作用。我们通过western blot和单分子定位的光学成像展示了乙酰化、去络氨酸化、络氨酸华微管蛋白在这种新型微管骨架结构形成的过程中的定量变化以及在微管骨架上的单分子定位。其中，我们第一次在人源血小板中展示了激活后血小板微管断续状的乙酰化状态。激活过程中，微管蛋白首先由高度乙酰化转变为去乙酰化，最终再度乙酰化并最终形成新的花状结构。断续状的乙酰化微管可能与微管机械稳定性相关。