Notch通路在ITP患者Th17/Treg平衡失调中的作用及机制研究

辅助性T细胞(Th)平衡失调在特发性血小板减少性紫癜(ITP)发病中占重要地位；Th17和Treg为新近发现的Th细胞，在ITP中研究较少；我们前期发现ITP中存在Th17/Treg上调，在ITP中具重要效应，其分化调控机制日益受到重视。Notch通路是细胞分化调控中极为重要途径，我们前期发现其在ITP中活性增高。本课题拟体外分离ITP CD4+ T细胞，测定Notch通路、Th17及Treg，进行相关性分析；干预Notch通路后，检测CD4+T细胞向Th17及Treg分化、CD4+增殖及凋亡的影响。建立主动型ITP小鼠模型，检测模型鼠Notch通路、Th17、Treg相关性；干预模型鼠Notch通路后，检测对Th17、Treg亚群及相关基因影响，观察临床症状减轻及改善情况。预期目标实现将会阐明Notch通路在ITP患者Th17/Treg失衡中的作用机制及治疗意义，为ITP治疗提供新靶点。

免疫性血小板减少症（ITP）是一种免疫介导的血小板破坏增多和生成减少而引起的自身免疫性疾病。辅助性T细胞（Th）免疫紊乱在ITP发病机制中占有重要地位，Th17和Treg是新近发现的Th亚群，Th17/Treg失衡会导致多种自身免疫性疾病，其分化调控机制日益受到重视。Notch通路是细胞分化调控的极为重要途径，影响多种细胞的分化、增殖和凋亡，阐明其在ITP患者Th17/Treg失衡中的作用及机制具有重要意义。本研究以ITP患者和正常健康人为研究对象，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)、免疫磁珠分选CD3+ T 细胞。首先利用RT-PCR、Wester blot及免疫细胞化学方法，证实Notch通路分子在ITP中异常升高；同时应用流式细胞术、RT-PCR及ELISA发现，ITP患者中存在Th17、Tc17、Th22、Th1、Tc1、IL-21及转录因子RORγt的升高，Treg及转录因子Foxp3的降低，Th17/Treg及RORγt/Foxp3比值的升高。为探讨ITP中Notch通路异常对Th17/Treg失衡的作用，我们使用DAPT抑制Notch通路，结果发现，抑制Notch通路后可降低ITP患者Th17、轻微升高Treg、纠正Th17/Treg比值失衡，还可降低ITP患者中Th17细胞因子IL-17及转录因子RORγt，而Treg相关细胞因子IL-10及转录因子Foxp3无明显变化，抑制Notch通路后还可诱导ITP患者PBMCs凋亡，PBMCs的增殖无明显改变。同时，我们还对Th17通路因子进行了干预，发现加入IL-17A或IL-21后，ITP患者PBMCs和CD3+T细胞中Th17百分比升高，Treg百分比、Treg/Th17比值及凋亡率降低，而经IL-17A抗体或IL-21抗体干预后，Th17百分比降低，Treg百分比、Treg/Th17比值及凋亡率升高。此外，体内实验，我们建立了ITP小鼠模型，通过体内干预Notch通路，初步观察到Th17/Treg失衡的逆转以及ITP症状的改善。本课题阐明了阻断Notch通路对ITP的发病及治疗意义，为ITP靶向治疗提供了理论学依据和实验室基础。