自数字化多功能单细胞分析芯片及其急性髓系白血病细胞异质性分析应用的研究

Cancer is a heterogeneous disease. Genotyping of cancer cells is helpful to the treatment and prognosis. A lot of developed methods for genetic analysis rely on the analysis of tumor cell populations, which is easy to omit the information from rare genetic components of individual cells. Single cell genetic analysis can reflect the differences between individual tumor cells and help to understand the role of genetic heterogeneity in cancer recurrence. Based on the advantages of digital PCR analysis and the technical difficulties in the field of single cell analysis, a self-digitized multifunctional single-cell analysis chip was designed and constructed to study the heterogeneity of cancer cells in acute myeloid leukemia. The chip consists of a single cell capture unit and a single cell genetic analysis unit. The high efficiency single cell capture and separation can be achieved by hydrodynamics without the usage of additional physical field, which simplified the equipment. Single cell analysis requires only two nanoliter reagents, significantly reducing the cost of analysis and improving sensitivity. Compared with the standard single-cell genetic analysis method based on 384-well plate, the chip can achieve high-throughput (10000 order of magnitude) single cell analysis, which can meet the requirement of statistical analysis. The as-developed chip was further applied to analyze the clinical samples of AML, which is helpful for clinical study, individualized diagnosis, treatment and prognosis of leukemia.

癌症是一种异质性疾病，对患者进行癌细胞基因分型可以指导治疗方案的选择及判断预后。目前发展的许多基因分析方法是对肿瘤细胞群体分析而容易遗漏掉来自稀有遗传组成的单个细胞的信息。单细胞基因分析能够反映肿瘤细胞个体间的差异，有助于理解遗传异质性在癌症复发中的作用。本项目借鉴数字PCR分析优势并结合单细胞分析领域的技术难点，设计并构建了一个自数字化多功能单细胞分析芯片用于急性髓系白血病（AML）细胞异质性研究。该芯片包含单细胞抓捕单元及单细胞基因分析单元，通过流体力学无需施加额外的物理场可实现高效率的单细胞分离，实验设备简单。单细胞分析只需两纳升反应试剂，显著降低分析成本并提高检测灵敏度。与基于384孔板的标准单细胞基因分析方法相比，该芯片可实现高通量（10000以上数量级）单细胞分析，满足种群统计所需的细胞数量。利用该芯片对AML临床样本进行分析，为白血病的临床研究、个性化诊疗及判断预后提供指导。

在大多数肿瘤中，在进化驱动下累积的突变通常会导致肿瘤细胞的基因型和表型多样性，从而导致不同细胞亚克隆的瘤内异质性。肿瘤的异质性实际上促进了实体肿瘤的侵袭和转移，最终导致治疗耐药性的出现和疾病恶化。然而，传统的研究主要是对细胞群的检测和分析，这掩盖了单个细胞之间的各种多样性。因此，在单细胞分辨率水平下开发先进的癌症研究技术是非常必要的。.这种异质性可以在基因组、转录组、蛋白质组和表型上表现出来。随着单细胞技术的逐渐成熟，肿瘤细胞的参数可以单独测量，能够详细阐明罕见细胞群的生物学特性。新兴的基于荧光激活细胞分选的微流控系统，无论是流式细胞术还是双乳液法，都被广泛应用于通过免疫荧光或核酸扩增策略进行精确的单细胞测量。然而，大多的技术需要预先将细胞和试剂封装在单个单元中，也仅限于单个指标的分析，难以实现多参数分析和在线观测。.在本项目中，我们提出了一种多功能微流控芯片，可以实现高效率的单细胞捕获、原位隔离和下游多参数分析。通过采用悬浮细胞/贴壁细胞和固定细胞/活细胞的多个实验来验证芯片设计的高效率分析性能。制备的芯片通过流体动力学控制捕获单个细胞，单细胞捕获效率高(88%，320个单元)。由于芯片设计精巧，原位数字免疫组化和环介导等温扩增(LAMP)可以在同一个隔离腔内单细胞水平进行，在未来的多组学研究中具有潜在的应用价值。此外，我们还进一步探索了该芯片在通过贴壁细胞原位增殖来评估细胞活性方面的巨大应用潜力。所提出的设计可以从多个维度促进对细胞异质性的理解，为单细胞研究提供了一个简便的工具，特别是对于依赖于多指标/生物标志物的诊断场景。该技术可以极大的促进单细胞水平的稀有的肿瘤细胞异质性研究。