长春花单萜吲哚生物碱生物合成途径中代谢物的胞间转运机制及代谢流调控初探

In Catharanthus roseus, monoterpene indole alkaloids (MIAs) biosynthesis pathway has complex development-, environment-, organ-, and cell-specific expression of pathway genes, which leads to the trafficking of biosynthetic intermediates between different organelles and also their movement between different cell types. According to the presence of intermediates trafficking, it’s assumed that the efficiency of intermediates transport should be the major cause for affecting metabolic flux in MIAs biosynthesis. In our previous works, we found that Catharanthus MIAs biosynthesis pathway contains at least 12 steps of intermediates transport and 3 of them occur between different cell types. In comparison with intracellular transport, intercellular transport of intermediates plays crucial role for regulating metabolic flux in the MIAs biosynthesis pathway, which including catharanthine transport from epidermal cells to leaf surface, loganic acid transport from internal phloem parenchyma (IPAP) cells to epidermal cells, and 16-methoxy tabersonine transport from epidermal cells to idioblast/laticifer cells. In 2013, we cloned catharanthine transporter, CrTPT2, and after silencing its expression, the production of 3’, 4’-anhydrovinblastine was increased about three times. Besides CrTPT2, functional identification of other transporters involved in loganic acid and 16-methoxy tabersonine translocation should be very helpful for improving metabolic flux in MIAs biosynthesis pathway, and then promoting MIAs production. In this project, we are going to investigate the mechanism of loganic acid and 16-methoxy tabersionine transport between different cell types. Combining with known catharanthine transporter, CrTPT2, successful cloning of loganic acid and 16-methoxy tabersionine transporters could make it possible for promoting MIAs biosynthesis by improving metabolic flux in the pathway.

长春碱作为高效抗肿瘤药物，其在长春花中的合成途径具有多细胞类型、多组织参与的空间复杂性，因此简单通过如过量表达代谢途径酶基因等手段并不能有效地提高代谢流通量、实现长春碱的高效合成。前期的工作中我们发现长春碱合成途径至少涉及到了9步胞内、3步胞间的中间代谢产物的定向转运，其中胞间的转运被认为是影响代谢流通量的关键因素，包括长春质碱由表皮细胞向叶片表面的转运；马钱苷酸由IPAP细胞向表皮细胞的转运；以及16-甲氧基柳叶水甘草碱由表皮细胞向异细胞/乳管细胞的转运。随着我们成功克隆长春质碱转运基因CrTPT2，并通过控制其表达，有效提升了三倍脱水长春碱的合成，其它两个中间代谢产物转运机制的阐明对于长春碱合成途径代谢流通量的调控便显得尤为重要。本项目中，我们将在原有工作的基础上，阐明马钱苷酸及16-甲氧基柳叶水甘草碱的转运机制，为调控长春碱合成的代谢流通量提供必要的基因元件及理论依据。

长春花单萜吲哚生物碱生物合成途径中，中间代谢产物的转运一直是限制该类化合物在植物中高效合成的主要因素，因此，揭示这些化合物的转运机理并克隆相应的转运基因是调控这些化合物高效合成的有效手段。与此同时，随着合成生物学的快速发展，这些高活性的小分子化合物有望在微生物底盘细胞中高效合成，但由于这些化合物具有很强的细胞毒性，因此若不能及时地从胞内移除，会极大地毒害细胞，影响微生物细胞对该类化合物的合成效率。基于此，代谢途径中这些小分子化合物转运机制的解析便显得尤为重要。在本项目中，利用转录组及代谢组的分析，并结合VIGS技术及转运实验，确定了多个能够调控长春花单萜吲哚生物碱生物合成的转运基因，其中两个分别已确定为色胺转运基因以及茉莉酸信号分子转运基因。近年来，对参与单萜吲哚生物碱生物合成的转运基因的研究有了很大的突破，除了项目负责人前期克隆的长春质碱转运基因外，目前也完成异胡豆苷以及环烯醚萜转运基因的鉴定。因此在所有单萜吲哚生物碱共同前体化合物异胡豆苷的生物合成中，色胺转运基因的发现便显得尤为重要。本项目中所克隆的色胺转运基因将极大丰富长春花单萜吲哚生物碱生物合成的调控手段，并有望同异胡豆苷转运基因一起，为以酿酒酵母为底盘细胞合成异胡豆苷提供新的调控策略。本项目所鉴定的另一个茉莉酸信号分子转运基因对长春花单萜吲哚生物碱生物合成的影响也证实了通过调控内源茉莉酸信号分子的亚细胞定位进而可有效调控其与受体分子的结合，从而实现对茉莉酸信号转导途径的有效调控，促进单萜吲哚生物碱在长春花中的高效合成。与此同时，在本项目中构建了长春质碱转运基因过表达的长春花毛状根，通过过表达该转运基因特异性地将长春质碱的产量提高了5倍，证实了代谢产物的转运对其生物合成及积累的有效调控。该项目培养在读博士生1名，毕业硕士生6名，在读硕士生1名；发表标注资助的SCI论文10篇，中文核心期刊论文5篇，申请发明专利1项。