假天青蛋白折叠的单分子力谱研究

Pseudoazurin (PAZ) has attracted the interests of many researchers for its unique structure and functions. Although traditional experimental approaches at the ensemble level provide more information on PAZ, the study of PAZ at the single molecule level is still rare. Single molecule force spectroscopy can offer some new properties to understand the protein folding at the single molecule level. In this project, atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy will be employed to study PAZ in combination with protein engineering and molecular dynamic simulation. We will focus on the process of folding/unfolding of PAZ, and the recognition/binding of copper ions during PAZ folding. We will attempt to capture the structure of the transient intermediate states, and even different protein folding pathways, if they exist. The kinetics of the folding/unfolding process will be also investigated. The energy landscape of PAZ folding process will be drawn from the experiments. We hope our study can enrich the information on the folding mechanism of the copper protein.

作为铜蛋白的一种，假天青蛋白独特的结构和功能引起了科研人员的极大兴趣。虽然传统的基于宏观层面上的实验研究极大地拓展了人们对假天青蛋白的认识，但是人们对其在单分子层面上的认识仍然不足。然而，单分子力谱技术的出现弥补了这一不足，它可以使人们在更加微观的层面上研究蛋白质折叠的机理。因此，本课题将借助基于原子力显微镜的单分子力谱这一有效的研究手段，并结合蛋白质工程和分子动力学模拟，来研究假天青蛋白的折叠行为。我们将从单分子的角度研究假天青蛋白的折叠/解折叠过程以及在这一过程中对铜离子的识别与结合。探索在折叠过程中有无瞬间存在的中间态，甚至可以观察到该蛋白分子不同的折叠路径，丰富人们对铜蛋白折叠过程的认识。在此基础上，本课题将进一步定量研究该蛋白折叠过程的动力学，从实验上描绘出该蛋白折叠的能量面的形貌，从而在能量面的层次上揭示出铜蛋白折叠行为的物理根源。

本项目以假天青蛋白（PAZ）为体系，采用基于原子力显微镜的单分子力谱技术结合分子动力学模拟，探索了在受控外力作用下单根PAZ分子链在不同条件下的展开过程。我们系统的研究了PAZ在不同状态（holo-PAZ和apo-PAZ）的力学行为。研究结果表明铜离子除了可以帮助PAZ完成其传递电子的功能外，还起到了稳定蛋白结构的作用；同时研究活性铜中心在其展开过程中行为，揭示了金属蛋白中金属离子与其周围配体之间的构型的不同，将会影响该金属离子的与配体之间的强度。此外，铜离子的存在使得PAZ蛋白的展开行为变得更加复杂，并观察到了展开过程中的中间态。通过上述研究，揭示我们成功过获得了PAZ蛋白展开/折叠的路径，并且分析了铜离子在这一过程中所起到的作用，为之后关于金属蛋白分子动力学模拟提供了可供参考的理论数据。基于该项目的研究，对我们研究与人类多种疾病（阿尔兹海默症、帕金森综合症和朊蛋白病等）相关的蓝铜蛋白提供了坚实的理论基础。