小麦抗纹枯病所需R类基因TaRCR1的功能与分子机制研究

Wheat sharp eyespot disease, primarily caused by the fungal pathogen Rhizoctonia cerealis, has been threatening wheat production in China since 2005. It is very necessary and urgent for the disease resistant wheat breeding to study wheat defense mechanism to Rhizoctina cerealis, to isolate important resistance genes and to develop effectively functional markers for molecular-assistant selection of the resisntance genes. We isolated a wheat resistance gene encoding a CC-NB-LRR protein, named TaRCR1, based on the results of differential expression profiles between Sharp eyespot resistant wheat Ci12633/Shanhongmai and the susceptible Wenmai6. The results of VIGS functional assays indicated that TaRCR1 was necessary for wheat defense response to Rhizoxtonia cerealis infection. The expression level of TaRCR1 was associated with the disease resistance degree. In this sproject, we plan to conduct the following researches: to clone the full-length sequences of TaRCR1 and related untranscript region sequences from different resistant and susceptible wheat cultivars, to mine interest allle variation of TaRCR1 in wheat cultivars/lines, to develop a functional molecular-marker by genetic link analysis, to study the biological function of TaRCR1 and the molecular mechanism underlying the function in wheat through assaying the overexpressing- and underexpressing-TaRCR1 , RNA-sequencing, gene network analysis softward, and mutiple mol-biological techniques including yeast-two-hybrid etc. This project will provide a theorical basis, a resistance gene resource, and a functional marker and technical assistance for wheat breeding with resistance against sharo eyespot.

小麦纹枯病是我国小麦生产上的第一大土传病害，难以防治。由于缺乏易于利用的抗源、抗性鉴定和选择困难，致使抗纹枯病育种进展缓慢。因此，分离小麦抗纹枯病重要基因，研究小麦抗纹枯病反应的防御作用机制，研发有效的分子标记，培育抗纹枯病小麦新品种，十分紧迫和必要。 本项目组前期开展了抗纹枯病小麦和感纹枯病小麦间基因差异表达谱、转录丰度与抗性关联分析，鉴定出1个小麦抗纹枯病R类基因TaRCR1，表达量与抗性成一定正相关，VIGS功能分析表明该基因是小麦抗纹枯病反应所必需的。本项目将从不同抗、感纹枯病小麦中，克隆该基因及其非编码调控序列，发掘优异等位变异，研发分子标记；利用遗传连锁分析、转基因小麦、分子检测与表型鉴定、测序、基因网络、酵母双杂交等分析，明确TaRCR1在小麦中的生物学功能和对纹枯病抗性的贡献率，揭示该基因作用的分子机制，为小麦抗纹枯病遗传育种提供理论依据、优异基因、分子标记和技术支撑。

纹枯病是我国小麦生产的第一大土传真菌病害。本项目根据比较转录组学及抗性表达分析结果，分离出一个小麦抗纹枯病所需的R类基因TaRCR1，其表达量受纹枯病菌的诱导；该基因定位于小麦染色体3BS上；TaRCR1编码由945个氨基酸构成的CC-NB-LRR的R类蛋白,亚细胞定位分析结果表明该蛋白分布在胞质和细胞核。抗病功能分析结果表明，TaRCR1基因沉默的小麦CI12633植株对纹枯病抗性显著下降，说明TaRCR1是小麦抗纹枯病重要基因； TaRCR1过表达显著增强了转基因小麦对纹枯病的抗性，说明TaRCR1正向调控小麦对纹枯病抗性反应，获得了抗纹枯病提高的转基因小麦新种质；从抗纹枯病小麦以及感病小麦中克隆出TaRCR1启动子序列和3’非编码区序列，解析了TaRCR1优异等位变异，发现该基因3’非编码区序列与抗病有关，开发出1个该基因的功能标记，能解释山红麦/温麦6 RILs群体对纹枯病抗性贡献率8.0%。解析了TaRCR1作用的分子机制，发现TaRCR1位于防御相关基因PR1、PR2、chitinase2和TaPIE1的上游，正向调控这4个基因的表达水平。这四个防御相关基因类似于aRCR1表达特性，不仅受纹枯菌的诱导，还受H2O2处理的诱导。接种纹枯菌12 h后，TaRCR1正向调控活性氧（ROS）清除相关基因CAT1、POX2的转录表达以及过氧化物酶的活性，负向调控ROS合成关键基因NOX的转录； TaRCR1基因过量表达减弱了纹枯菌侵染引起的ROS积累；对转TaRCR1基因小麦喷施过氧化物酶合成的抑制剂NaN3，降低了TaRCR1过表达植株对纹枯病的抗性，说明小麦体内ROS的动态平衡对于TaRCR1介导的纹枯病抗性非常重要，TaRCR1通过调控ROS相关基因的表达维持ROS的动态平衡，促进PR1、PR2、chitinase2和TaPIE1的表达，进而正向调控小麦对纹枯病的抗性反应。并鉴定出1个与TaRCR1互作的蛋白TaPP2Ac.TaPP2Ac基因沉默的小麦对纹枯病抗性增强。该项目发表相关学术论文5篇，其中SCI论文4篇，获得国家发明专利1项。 本项目揭示了一个小麦R类基因在抗纹枯病反应中的重要调控作用，为小麦抗纹枯病分子育种提供新的基因资源、功能标记和理论支撑，具有较重要的理论意义和应用价值。