环状RNA-CRIRTM靶向microRNA-1调控心肌缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡的分子机制研究

Currently myocardial reperfusion therapy is the most efficient method to save the dying myocardial cells, however, it may also cause myocardial ischemia-reperfusion injury, with the mechanism almost unknown. Our previous studies found that the expression of circular RNA CRIRTM was significantly up-regulation in the myocardial ischemia-reperfusion through RNA sequencing technology. Recent studies found that Calmodulin, as effecting intracellular calcium overload, involved in regulating myocardial apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. The bioinformatics analysis showed that MIR-1 may be the target of Circular RNA CRIRTM. This issue means to develop the following studies according to the previous findings on cardiac myocytes H9C2: (1)Verifying the regulation of CRIRTM targeting MIR-1 through RNA-Pulldown and up-regulated of CRIRTM with lentivirus or knockout CRIRTM by Crispr-cas9 technology. (2)Verifying the regulation of miR-1 targeting Calmodulin protein through luciferase experiment. (3)Illustrate that the important role of CRIRTM-microRNA-1-Calmodulin in apoptosis of in ischemia-reperfusion injury. (4)Investigating the clinical plasma samples and animal models to further demonstrate the results of issue. Hereby, the study could enrich the molecular mechanism of myocardial apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury, serving as the novel scientific basis for preventing myocardial from ischemia-reperfusion injury.

再灌注治疗目前是挽救濒死心肌的最重要手段，然而同时可能引发缺血再灌注损伤，其机制尚未完全阐明。本课题组通过高通量测序发现环状RNA-CRIRTM在心肌缺血再灌注时特异性上调，而钙调蛋白(CaM)可能通过调控胞内钙超载参与调节缺血再灌注损伤中心肌凋亡，生物信息学分析MICRORNA-1可能受CRIRTM调控从而影响下游蛋白CaM。本课题拟在前期基础上对心肌细胞H9C2开展以下研究：(1)利用RNA-Pulldown及慢病毒上调或Crispr-Cas9技术敲除CRIRTM验证其对MIR-1的靶向调控作用；(2)利用荧光素酶报告基因验证MIR-1对CaM的靶向调控；(3)阐明CRIRTM-MIR1-CaM轴影响心肌缺血再灌注中凋亡的分子机制；(4)利用动物模型和临床标本进一步验证结果。以求为缺血再灌注引起心肌凋亡的机制阐明注入新的见解，同时也为达到更好地防治心肌缺血再灌注损伤提供新的理论依据。

缺血-再灌注损伤是一项医学治疗的巨大挑战，其是心肌梗死再灌注后预后不良的重要元凶。其病理生理过程包括活性氧（ROS）的过量产生，钙超载，炎症反应等，其造成细胞损伤机制包括自噬，细胞凋亡，坏死等。细胞凋亡是细胞程序性死亡，其在低氧应激下产生，尽管其在诸多生物学进程中起着重要作用，但在心肌细胞缺血再灌注损伤仲的分子调控仍有待阐明。MicroRNA（miRNA）是具有19-25个核苷酸的内源性短非编码RNA分子。可调节靶基因的转录后翻译。MiRNA参与多种细胞事件的调控，例如细胞凋亡，增殖，发育，分化和细胞转化。几种miRNA确定与细胞凋亡有关。MicroRNA‑93调控骨关节炎中的软骨细胞凋亡。miRNA-143促进胰腺癌的细胞凋亡。但是，关于心肌细胞中关于MiRNA调节缺血再灌注损伤的机制，目前仍是未知的。而环状RNA（CircRNA）是一类长链非编码RNA，它们的特点是形成共价闭合的连续环，既没有5'–3'极性，也没有polyA尾巴。最近的证据表明，circRNA参与调控多种疾病的进程，包括动脉粥样硬化性心脏病，神经系统疾病，糖尿病等。其还可以充当多种类型肿瘤的标志物。然而circRNA对于是否能够调控心肌细胞凋亡仍然是未知的。. 我们目前的工作表明，Calmodulin（CaM）是MIR-1的靶标，而MIR-1参与了Calmodulin翻译的抑制。MIR-1通过在体内和体外靶向Calmodulin抑制细胞凋亡。此外，我们的研究进一步表明，环状RNA（CRIRTM）直接与MIR-1结合，因此抑制了其活性。CRIRTM通过MIR-1调节Calmodulin的表达以及由此引起的心肌细胞凋亡。简而言之，CRIRTM通过靶向MIR-1 / Calmodulin途径来调节心肌细胞程序性死亡。我们的研究为circRNA和miRNA在心肌细胞凋亡调控中的相互作用提供了新的认识。