bFGF/VEGF基因修饰肌腱干细胞治疗肌腱损伤的研究

This study aims to enhance the tendon healing and reduce adhesion formation by introduction of gene-modified tendon stem cells (TSPCs) in vivo and in vitro. Firstly, we isolate and culture the tendon stem cells from flexor tendons of chicken toes. Secondly, we chose the most important growth factors (bFGF and VEGF) in tendon healing to construct plasmid vectors, pEGFP-N1-bFGF、pEGFP-N1-VEGF, which are used to prepare the gene-modified TSPCs. Finally, we introduce the gene-modified TSPCs to the injured tendon and determine their effects on tendon healing. This study is based on a series of our investigations of cellular and molecular mechanism in tendon healing during the past ten years. It combines the gene therapy and tendon stem cells therapy, which would simultaneously supplement the injured tendons with cells and growth factors needed in the repair process. The ultimate purpose of this study is to explore the novel technique to resolve the clinical problem of tendon healing.

本研究拟采用生长因子基因修饰的肌腱干细胞（TSPCs），促进肌腱损伤愈合，同时降低粘连发生。首先，我们分离培养TSPCs并进行干细胞鉴定；接着，选取在肌腱愈合过程中发挥重要作用的两种生长bFGF和VEGF进行基因转染，构建质粒表达载体pEGFP-N1-bFGF、pEGFP-N1-VEGF并转染体外培养的TSPCs，制备bFGF或VEGF基因修饰TSPCs；最后，检测基因修饰TSPCs对离体、在体损伤肌腱愈合的调控作用，为过度到临床使用提供分子生物学及生物力学依据。本研究立足于过去十余年我们对肌腱损伤后一系列的细胞、分子机制研究，并延续了多年转基因治疗肌腱损伤的工作，同时整合了组织工程上最常使用的干细胞治疗方法，使得两者结合发挥双重效应，补充了肌腱愈合过程中急需的细胞和生长因子。本研究最终旨在将次探索成功的方法用于临床肌腱修复，以期解决手指肌腱愈合能力低这一难题。

手部肌腱断裂是创伤外科常见损伤之一，多年临床实践表明，尽管手部肌腱损伤后临床缝合方法和康复方案不断优化和完善后，其功能恢复得到极大提高，但肌腱愈合效果往往不尽人意。 肌腱自身的血供不足、营养来源有限，特别是鞘内肌腱细胞数量少，生长因子水平低，导致其内源性愈合能力弱。因此，针对肌腱愈合过程中再生所需种子细胞及生长因子水平均较低的情况，我们设计并开展了此项研究工作。首先，我们建立 肌腱干细胞（TSPCs） 的体外培养体系，鉴定 TSPCs 克隆、分化能力和表面标记物的表达情况。成功摸索处最佳的TSPCs克隆形成的培养体系（包括细胞接种密度、传代时机等），优化了 TSPCs 三系分化的实验流程；其次，构建真核表达载体pEGFP-N1-bFGF、pEGFP-N1-VEGF，转染成熟培养的TSPCs，制备基因修饰型TSPCs；第三，检测基因修饰 TSPCs 对离体损伤肌腱的作用。转染外源性 bFGF和VEGF，转染效率达到预期目标，同时体外培养的肌腱组织愈合强度得到提升，为后续体内实验奠定基础；第四，检测基因修饰 TSPCs 对在体损伤肌腱愈合的作用。结果表明，移植基因修饰型TSPCs，术后 2周肌腱愈合强度已经明显上升，术后4周滑行位移显著上升，粘连评分显著下降。在体实验中我们不仅发现肌腱修复得到改善，还发现肌腱粘连得到缓解，说明转染了细胞因子的TSPCs还通过某些机制调控肌腱粘连的形成。本研究的结果，不仅与我们以往相关研究结果相吻合，说明肌腱干细胞与细胞因子的结合确实能改善肌腱损伤后的愈合状况，而且在我们研究过程中还有一些新的发现。比如，肌腱细胞的状态能够影响肌腱干细胞的增殖等。这也进一步开拓了我们对肌腱损伤研究的思路。