含多氢键给体的高分子的合成及其作为基因载体的性能研究

寻找安全、高效的基因载体是基因治疗的关键问题之一。本研究拟通过原子转移自由基聚合合成直链型和星型聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）。PGMA具有良好的生物相容性，侧链可降解，具有活性环氧基团。使用不同单胺、二胺和多胺分别对其进行聚合后修饰，得到一系列新型胺基PGMA；环氧基团开环时生成多羟基，能够与生物分子发生氢键作用。在此基础上，引入可以与核酸的磷酸基形成强氢键的硫脲，得到硫脲胺基PGMA。胺基PGMA和硫脲胺基PGMA通过静电和氢键的协同作用与反义寡聚核苷酸（AON）形成纳米复合体。由于多氢键的协同作用，高分子可以在较低的N/P 比例下与AON形成复合体，从而降低细胞毒性；通过氢键作用结合的AON更容易在细胞内释放，从而提高基因转染效率。系统研究高分子结构对其AON复合体的稳定性、细胞毒性和基因转染效率的影响。优化高分子组成，有望开发新型高效、低毒的基因载体。

尽管人们认为阳离子高分子是目前核酸给药的适宜载体，但为提高核酸的转染效率，通常需要过量的正电荷，而过量的正电荷会产生细胞毒性；但是，中性复合体或者+/-电荷比例较低的复合体一般又不稳定。寻找安全、高效的基因载体是基因治疗的关键问题之一。聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）具有良好的生物相容性，具有活性环氧基团，其开环产物聚甲基丙烯酸甘油酯（PGOHMA）中的多羟基能够提供氢键作用。首先，为了提高AON转染效率, 用异丙胺(MEA)，2-氨基-1-丁醇(2-ABO)和4-氨基-1-丁醇(4-ABO)三种具有不同氨基的小分子分别对PGMA进行聚合后修饰，得到一系列新型胺基PGMA；环氧基团开环时生成多羟基，能够与生物分子发生氢键作用。在Tris缓冲溶液中，这些氨基PGMA能够在N/P比例较低（0.5-3）时与AON自组装形成稳定的纳米复合体。AON与氨基高分子形成复合体后可以避免脱氧核糖核酸酶 I 对AON的酶解作用。除了具有较高分子量（30 kDa）的胺基PGOHMA具有较大的细胞毒性外，其它胺基PGOHMAs与PEI25k相比毒性较小。与PEI25k相比，MEA修饰的直链和星形PGOHMA（分子量在15-20kDa），以及4-ABO修饰的直链PGOHMA具有更高的体外转染效率。其次，为进一步提高转染效率和降低细胞毒性，将氨基PGMA的叔胺基季铵化得到相应的季铵盐（QPGMA）。使用Huh-7细胞进行体外实验。与季氨化前相比，QPGMA/pDNA复合体的细胞毒性较小，转染效率高。流式细胞仪测试显示氨基PGMA季氨化能够提高细胞对pDNA的摄取，这有助于转染效率的提高。实验结果表明：将氨基PGMA季铵化后可以用作DNA安全、有效的载体。最后，研究发现硫脲基团可以与pDNA上的磷酸基团产生较强的作用。本研究将氨基PGMA用异硫氰酸甲酯和异硫氰酸丙酯进行修饰，得到氨基硫脲PGMA (TPGOHMA)。由于多氢键的协同作用，高分子可以在较低的N/P 比例下与AON形成复合体，从而降低细胞毒性。具有偶数氨基重复单元的TPGOHMA显示很好的内涵体逃逸作用，从而提高基因转染效率。总之，本项目通过对PGMA进行聚合后修饰和结构优化，开发了一系列与核酸具有氢键作用的高转染效率、低细胞毒性的阳离子高分子基因载体，可望在临床获得实际应用。