Ca2+ —CaMKs介导的电刺激促轴突生长作用及机制研究

周围神经缺损治疗是仍未解决的世界性难题。电刺激（electrical stimulation，ES）能够促进轴突生长，加速神经再生，但作用机制至今尚未明确。我们前期研究发现，电刺激能够促进背根神经节轴突生长，增加细胞内钙离子（Ca2+）浓度，且二者具有相关性。本项目拟应用前期建立的体外细胞电刺激模型，通过检测不同电刺激参数对轴突生长的影响，筛选最佳刺激参数，优化电刺激模型；进而应用药理学方法，从细胞外钙内流和细胞内钙库释放两方面，研究电刺激促轴突生长过程中，升高的细胞内钙离子主要来源；选取钙调蛋白激酶（CaMKs）为对象，应用其相应的抑制剂，确定参与ES促轴突生长的CaMKs类型， siRNA技术进行验证，并对其下游信号通路中的关键组分（如CREB等）展开研究，探讨Ca2+-CaMKs介导的电刺激促轴突生长的可能机制，为电刺激应用于临床神经损伤修复提供必要的实验数据和理论支持。

本项目基本按照项目任务书研究内容及计划完成。.周围神经缺损治疗是仍未解决的世界性难题。大量文献报道和我们前期研究发现，电刺激能够促进轴突生长，加速神经再生。我们进一步的研究发现，电刺激能够促进背根神经节轴突生长，增加细胞内钙离子浓度，且二者具有相关性，但具体作用机制尚不清楚。.为此，本项目在体外原代培养背根神经节神经元的基础上，构建体外细胞-电刺激模型，全面筛选可有效促进神经元突起生长的电刺激参数，并研究可能参与此过程的关键分子及信号通路，为深入理解电刺激促周围神经再生的分子机理提供新的实验依据和理论基础。.主要的研究结果：（1）使用无血清Neurobasal/B27培养基、低密度体外原代培养背根神经节神经元，纯度可达到(92±6)%；（2）从双/单相、刺激时间、刺激电压、刺激频率这四个方面对神经元进行电刺激干预，免疫细胞化学染色后，利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量突起长度，筛选出可有效促进突起生长的电刺激参数如下：双相电、刺激30min、电压5V、频率10Hz；（3）利用激光共聚焦/钙成像技术结合药理学实验观察到，电刺激作用下神经元胞内钙离子水平上升，并确定了胞内增加的钙离子来源于两个途径：① L、N型电压依赖性钙通道（L-VDCC、N-VDCC）参与钙离子从胞外向胞内的转运；② 三磷酸肌醇受体（IP3R）钙库和斯里兰卡肉桂碱受体（RyR）钙库参与胞内钙动员过程；（4）通过阻断钙离子来源并从分子和mRNA水平，观察到电刺激过程中神经元突起再生加快，神经元表达c-fos、BDNF增加且呈现明显的钙依赖性；（5）在电刺激作用下，抑制钙-钙调蛋白依赖的蛋白激酶（CaMKs）后，神经元中磷酸化的环磷酸腺苷-反应元件结合蛋白（pCREB）、c-fos、BDNF表达下降，并出现电刺激促进突起再生作用减弱，说明CaMKs参与电刺激增强神经元中pCREB、c-fos、BDNF的表达，并参与电刺激促进神经元突起再生。.上述研究结果表明，在适宜的电刺激作用下，通过L-VDCC、N-VDCC、IP3R钙库和RyR钙库等多重途径使神经元胞内钙离子水平上升，胞内增加的钙离子使CaMKs活性增强，进而增强了CREB的磷酸化程度，pCREB作用于靶点基因c-fos和BDNF，加强二者转录和翻译，使神经元表达c-fos和BDNF上调，从而达到促进神经元突起再生。