乙醇酸合成途径基因在大肠杆菌中的模块化协调表达

Glycolic Acid (glycolate) is the smallest member of the alpha-hydroxy acid family of carboxylic acids. It has been widely used in the leather industry, textile industry, cosmetics industry and pharmaceutical industry. Previously, the genes responsible for glycolate synthesis: aceA, aceK, ycdW were over-expressed in E. coli. But the yield of glycolate was low and the cell growth was impaired. The reason for the low yield is mainly because the imbalanced over-expressions of the genes related to glycolic acid synthesis causes the metabolic burden, which over-accumulates glyoxylate, greatly reduces TCA cycle and impairs the cell growth. In order to solve the problem, the genes related to glycolic acid production will be separated into two modules by glyoxylate node. The gene expressions in the same module will be balanced through designing ribosome binding site (RBS), which could regulate the target genes’ translations. In order to convert most of the glyoxylic acid to glycolic acid, the two modules will be balanced by using different mutant promoters from functional promoter library. The methods generated by this project will build a broad avenue for over-producing other metabolites in E. coli.

乙醇酸是分子量最小的果酸，它在化妆品，制药，纺织和制革等行业应用广泛。申请人前期在大肠杆菌中过量表达了异柠檬酸裂合酶基因（aceA），异柠檬酸脱氢酶基因激酶/磷酸酶（aceK）和乙醛酸还原酶基因(ycdW)，实现了乙醇酸的积累，但是产率很低，细胞生长缓慢。导致这一结果的主要原因是乙醇酸合成途径中各基因的不协调大量表达，导致绝大多数异柠檬酸流入乙醇酸途径，损害TCA循环，并且使菌株大量积累乙醛酸，最终造成代谢负荷和细胞毒性。为了解决此问题，本项目拟将催化乙醇酸有关的基因以乙醇酸前体——乙醛酸为节点，建立上游和下游表达模块；然后对处于同一模块的基因，通过调整核糖体结合位点，理性的在翻译水平调控这些基因对应的酶合成量，从而协调代谢途径每个催化步骤。最后，通过建立功能启动子文库，依靠不同强度的启动子的组合，协调不同模块的表达量，实现乙醛酸向乙醇酸的高效转化。该研究为理性设计大肠杆菌过量表达代谢产物奠定基础。

乙醇酸（Glycolic Acid，Glycolate）是最简单的α-羟基酸，被广泛应用于化学清洗、生物降解、日用化工、纺织工业等行业。异柠檬酸裂解酶（aceA）、乙醛酸还原酶（ycdW）和异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸化酶（aceK）作为乙醇酸合成的三个关键酶，其表达水平对乙醇酸的合成至关重要。利用不同拷贝数的表达质粒来调节三个目的基因的表达的发酵结果显示，中拷贝表达质粒相比低拷贝或高拷贝表达质粒其目的蛋白的表达量及酶活都更高，且乙醇酸产率和产量也最高，分别为0.258 g-乙醇酸/g-葡萄糖和1.27 g/L。通过T7启动子、pTet启动子和pTrc启动子分别表达目的基因的发酵实验结果显示，pTrc启动子表达关键基因时，乙醇酸产率大幅度提高，为0.385 g-乙醇酸/g-葡萄糖。. 为了增强乙醇酸的合成途径及减少乙醇酸的代谢，本研究在宿主菌株Mgly1（MG1655(DE3) ) ΔldhA）中敲除敲除苹果酸合成酶基因（glcB，aceB）获得重组菌株Mgly345，敲除乙醇醛脱氢酶基因获得重组菌株Mgly445, 敲除乙醇酸氧化酶基因（glcDEF）获得重组菌株Mgly545。Mgly345的乙醇酸产率提高到0.750 g/g-葡萄糖，达到理论产率的88.2%，较Mgly145提高了49%。重组菌株Mgly445的乙醇酸进一步提高到0.79 g/g-葡萄糖，达到理论产率的92.9%。重组菌株Mgly545的乙醇酸产率为0.678 g/g 葡萄糖。基于上述研究结果，选用Mgly445作为后续研究的出发菌株。. 本研究通过发酵优化后，5L发酵罐分批发酵77 h时，乙醇酸产量达到65.5 g/L（目前报道的最高值），产率为0.765 g/g葡糖糖，总消耗葡萄糖为85.6 g/L，生产强度为0.85 g/(L*h)。本研究为深入了解乙醇酸在大肠杆菌中的合成过程、调控和积累的分子水平机理提供了理论基础，并为其它羧酸在大肠杆菌中的全生物合成开拓新的研究思路。