PU.1蛋白调控原癌基因Evi3表达机制研究

Proto-oncogene Evi3, which is involved in the regulation of gene transcription, is expressed in various stages of B cell development. Leukemia occurrs when Evi3 is overexpressed in B lymphocytes of mouse. Evi3 is also oeverexpressed in acute myelocytic leukemia（AML）and abnormally expressed in the B-cell precursor cells of human acute lymphoblastic leukemia (ALL). So it is evident that Evi3 is involved in the occurrence of leukemia. At present, the Evi3 function is not studied in detail, and the mechanism of Evi3 induced leukemia is unclear, let alone the expression regulation of Evi3. We found two PU.1 protein binding sites in Evi3 gene promoter by bioinformatics analysis and our Q-RT-PCR results showed that the expression of PU.1 and Evi3 is correlative in B lymphocyte cell line，so we presumed that Pu.1 activate Evi3 expression. Our preliminary luciferase assay data showed that PU.1 activates Evi3 expression. In this project, we will determine the Evi3 transcriptional regulation mechanism by PU.1 protein and analyze the effect of PU.1 on Evi3 regulating protein such as Pax-5 and EBF-1 and on leukaemia development. These efforts will clarify the role of PU.1and Evi3 in leukemia pathogenesis and provide new strategy for the prevention and treatment of leukemia.

新发现的原癌基因Evi3在B淋巴细胞发育的各个阶段都表达；小鼠B淋巴细胞过表达Evi3后发生白血病。同时Evi3在急性髓性白血病细胞和人急性淋巴细胞白血病的B细胞前体细胞的表达水平高，因此，Evi3参与了白血病的发生。目前对B淋巴细胞如何调控Evi3表达一无所知。我们发现Evi3基因启动子有两个PU.1蛋白结合位点，PU.1和Evi3表达水平在淋巴细胞系细胞中是正相关的，PU.1表达水平高的细胞Evi3表达水平也高，反之也然；因此我们认为Pu.1参与了Evi3基因的调控。Luciferase assay初步结果也表明PU.1激活Evi3表达。在本项目中，我们将确定PU.1对Evi3的转录调节，阐明PU.1激活Evi3机理， 并分析其对下游基因如Pax-5 和EBF-1的影响及在白血病发生中的作用。这些工作将阐明Evi3在白血病发病过程中的作用机制，为预防和治疗白血病提供新的思路。

原癌基因Evi3 在干细胞、造血细胞以及淋巴细胞都有表达；Evi3 在急性髓性白血病细胞和人急性淋巴细胞白血病的B 细胞前体细胞的表达水平升高。小鼠B 淋巴细胞在插入逆转录病毒导致过表达Evi3 后发生白血病则表明Evi3与白血病的发生有着重要的作用。虽然很多研究分析Evi3蛋白在干细胞分化、成骨组织及软骨组织的作用，但细胞如何调控Evi3目前还没被报道。在本项目我们分析了如何调控Evi3的表达。通过分析发现Evi3 基因启动子有两个PU.1 蛋白结合位点，PU.1 和Evi3表达水平在淋巴细胞系细胞中是正相关的，因此分析了PU.1 如何参与Evi3 基因的调控，并对下游基因的影响。Luciferase assay分析表明PU.1 激活Evi3 表达; BA/F3细胞过表达PU.1后，Evi3的表达水平也随之上升，而knockdown PU.1则PU.1的表达水平下降，这些数据表明PU.1确实在细胞内激活Evi3的表达。通过染色质免疫沉淀分析表明PU.1在BA/F3与Evi3的启动子相结合，而EMSA实验表明该结合发生在Evi3的PU1a和PU1b结合位点区域。在突变PU.1的结合区域和激活区域的luciferase assay发现，突变结合区域可丧失PU.1的激活能力，但转录激活的突变并不能导致激活能力的丧失，因此PU.1激活Evi3是通过与Evi3的PU1a和PU1b结合位点相结合完成的，但该激活并不需要PU1转录激活区域的参与。进一步研究表明HOXC13也参与了PU.1激活Evi3。PU.1和HOXC13及Evi3启动子结合共同作用导致Evi3的激活，PU.1和HOXC13的协同作用导致Evi3的激活。而过表达Evi3提高了下游基因EBF-1、B29、mb-1和Pax5基因的表达。表达Evi3促进细胞增殖和细胞克隆，而knockdown Evi3则细胞生长缓慢及细胞凋亡发生。我们项目确定了PU.1和HOXC13协同激活Evi3的机制，并发现其促进下游基因下游基因EBF-1、B29、mb-1和Pax5的表达，从而促进细胞增殖及细胞克隆发生。本项目为进一步研究细胞如何调节Evi3，分析Evi3在细胞中的功能打下基础。并为预防及治疗白血病提供新的思路。