neurexophilin调控母鸡贮精腺精子贮存的分子机制研究

鸡基因组测序草图已完成，鸡也成为禽类分子生物学研究中极有价值的模式动物。禽类精液在体外只能短暂保存，而精子在母禽体内高温环境却能长时间保存，其长期存活与特异表达基因所控制的微环境有关。我们在前期研究中获得鸡贮精腺差异表达基因neurexophilin，分析该基因多态性与母鸡持续受精的关系，从mRNA水平和蛋白质水平分析该基因表达谱，发现该基因通过其表达参与母鸡贮精腺精子贮存，输精后neurexophilin在母鸡贮精腺周围细胞的外侧表达，其表达水平与母鸡受精率呈正相关。故本项目用RNA干扰沉默neurexophilin在贮精腺及其培养物内的表达，在毕赤酵母系统中表达该基因，研究离体和在体条件下该基因对母鸡贮精腺微环境的影响及其与精子贮存时间的关系，从而揭示neurexophilin调控贮精腺精子贮存的机制，研究结果有利于探明禽类贮精腺的贮精原理，而且可为开发液态精液体外保存新方法提供思路。

本研究以鸡为研究对象，研究母鸡的贮精腺生理及其分子调控对阐明禽类精子贮存机制及开发液态精液体外保存新方法具有显著意义。本研究（1）设计引物扩增鸡贮精腺差异表达基因neurexophilin 1的全序列，寻找鸡neurexophilin 1基因的多态位点，发现该基因受到强烈的纯化选择，该纯化选择导致该蛋白非常保守。对鸡neurexophilin 1基因从启动子区到全基因进行多态性研究，将鸡neurexophilin 1基因序列多态性与海兰鸡和新扬州鸡的贮精性状进行关联分析，发现该基因多态与贮精性状无关。（2）用免疫组化法研究neurexophilin 1在鸡生殖道的分布，发现该基因在附睾和母鸡生殖道表达，但各表达部位的表达量有差异且输精后表达量更明显，荧光定量该基因在母鸡生殖道各部位的表达情况，发现输精后该基因在母鸡子宫和输卵管伞部的表达显著升高，但该基因在贮精腺的表达却没有显著差异。（3）构建neurexophilin 1的siRNA表达载体，重组质粒转染鸡成纤维细胞，结果发现干扰后下调neurexophilin 1的表达，与空载体组相比较，干扰不影响培养液的Ca2+浓度和碳酸酐酶浓度，而干扰后培养液pH值和酸性磷酸酶浓度显著下降。（4）构建鸡neurexophilin 1基因的真核表达载体，并在毕赤酵母中表达获得蛋白，且诱导表达72小时时表达量最高。将表达蛋白加入鸡成纤维细胞培养液，发现加入蛋白后酸性磷酸酶和pH值显著增加，Ca2+浓度则显著降低，而碳酸酐酶没有显著改变。(5)将270只鸡随机分成三组，分别输入精液、加空载体蛋白的精液和加neurexophilin 1基因表达蛋白的精液，输精后第6天再次输精，第一次输精后第三天开始收集种蛋，连续收集7天的种蛋，计数蛋黄膜上的精子穿孔数，发现在精液中加入表达蛋白输精后精子穿孔数低于输精液组，但从第4天开始输表达蛋白+精液组的精子穿孔数显著高于输空载体蛋白+精液组的精子穿孔数，说明表达的蛋白可增加精子穿过卵黄膜的能力，从而可提高受精率。