转录因子BCLAF1在细胞凋亡调节机制中作用的研究

作为一种积极排除生物体内过剩和有害细胞的机制，细胞凋亡与肿瘤的发生发展及治疗密切相关。不少肿瘤的发生机制就是由于凋亡受阻引起的，如淋巴瘤、乳腺癌、结直肠癌等。凋亡相关基因改变所导致的肿瘤细胞凋亡的抑制,也可能是肿瘤耐药的一个原因。然而迄今为止细胞凋亡的调节和执行机制尚不明了。促凋亡转录因子BCLAF1在多种细胞中诱导细胞凋亡，其表达或传导通路异常可能导致疾病或肿瘤耐药，然而关于BCLAF1分子水平的凋亡调节机制鲜有报道。本项目拟用RNAi及Affymetrix基因表达谱芯片技术寻找BCLAF1的下游基因，以染色质免疫沉淀分析等评价BCLAF1对靶基因的调节机制，以TUNEL法等观测BCLAF1及靶基因对凋亡的诱导活性，为探讨BCLAF1诱导的p53非依赖性细胞凋亡信号传递通路提供理论依据，并为阐明凋亡调节基因在肿瘤发生发展及治疗中的作用，寻找新型肿瘤治疗靶基因提供新线索，开发新思路。

作为一种积极排除生物体内过剩和有害细胞的机制，细胞凋亡与肿瘤的发生发展及治疗密切相关。促凋亡转录因子BCLAF1在多种细胞中诱导细胞凋亡，其表达或传导通路异常可能导致疾病或肿瘤耐药，然而关于BCLAF1分子水平的凋亡调节机制鲜有报道。本项目的主要研究目标是利用基因表达谱芯片技术，寻找促凋亡转录因子BCLAF1的下游凋亡调控基因，以探讨BCLAF1诱导的p53非依赖性细胞凋亡的分子调节机制，最终为阐明凋亡调节基因在肿瘤发生发展及治疗中的作用，寻找新型肿瘤治疗靶基因提供新线索，开发新思路。我们使用了RNAi及Agilent 人全基因4*44K单通道表达谱芯片，首先筛查出BCLAF1的候选靶基因439个。进一步采用GO等统计学方法寻找BCLAF1与凋亡诱导相关的下游基因，确定可能的靶基因15个。通过染色质免疫沉淀分析及定量PCR等手段，发现BCLAF1可以直接结合到ERCC2和SMAD3的启动子领域并促进两者的转录活性，提示ERCC2和SMAD3为BCLAF1直接调控的下游因子的可能性较大。然而通过RNAi及Western blot等试验验证发现，BCLAF1对ERCC2的调控在蛋白质水平上并不明显，提示BCLAF1的凋亡诱导靶基因可能为SMAD3。使用RNAi、过表达法及TUNEL法等发现SMAD3在细胞凋亡诱导中起诱导作用，且SMAD3的细胞凋亡诱导作用受BCLAF1调控，进一步支持SMAD3是BCLAF1靶基因的假说。我们的研究提示，BCLAF1可以直接促进SMAD3的转录活性，通过提高SMAD3的表达来诱导非p53依赖性细胞凋亡。且以往的研究显示，SMAD3在白血病细胞，胃癌组织，贲门腺癌组织等的表达均明显降低，SMAD3在放疗及多种化疗药物诱导的细胞凋亡作用中均起促进作用，提示Smad3作为一个细胞凋亡促进因子，与肿瘤的发生发展密切相关，不仅可以作为一个肿瘤治疗的靶标，而且它的表达量监测还可以作为诊断辅助手段检测肿瘤的进程。