扬子鳄精子储存机理及性选择机制研究

The Chinese alligator (Alligaotr sinensis) is an endemic endangered species of Reptile. The ability of females to store sperm and utilize it at later date is a critical component of many mating systems across taxa,especial in many reptiles. The genetic benefits of facilitating sexual selection through sperm storage may be particularly important. It optimizes offspring genetic variation and promotes the sex behavior of male-female, evolution of sex physiology and conservation of genetic resources. But it is less known about these in the Chinese alligators. In this project, the microscope, immunohistochemistry were used to determine the location and duration of sperm storage and expression of three sex hormone(Androsterone,Estrogen and Progesterone) receptors in the oviduct of Chinese alligator.The whole genomic RNA sequencing was used to analyse the gene expression. And microsatellite DNA analysis were used to analyse the parentage analysis and genetic biases to paternity by clustering offspring into full-sibling and sub-sibling. From researches, we can determine the ability,characteristic and the mechanism of sperm storage in Chinese alligators, and make known the mechanism of optimizing genetic variation of offspring through sex selection. the results of this researches will provide some scientific evidences for the Parentage analysis, breeding pedigree foundation and genetic resource protection of Chinese alligators.

雌性储存精子并在受精后加以利用是很多分类群（尤其爬行动物）交配系统的重要特征, 它通过性选择使得繁殖后代遗传变异性最优化并驱动着雄性和雌性性行为和性生理的进化，在遗传资源保护中具有重要意义，而我国特有珍稀濒危爬行动物扬子鳄在这方面鲜有研究。本项目拟采用结构生物学（显微结构）、免疫组织化学、全基因转录组测序及微卫星DNA基因分型相结合方法，研究扬子鳄输卵管内精子储存的位置和时间，精子储存部位的三种性激素（雄激素、雌激素和孕激素）受体的表达，精子储存部位与非储存部位的基因表达调控，以及在利用亲权分析对每窝卵子代的双亲姊妹或单亲姊妹进行分类的基础上重点研究子代基因偏向性和子代遗传结构的影响。以探讨扬子鳄精子储存特点和储存机理，揭示这种性选择对繁殖后代遗传杂合性的影响规律。研究结果将为扬子鳄等濒危物种的亲缘关系分析、繁殖谱系建立和遗传资源保护等积累宝贵的科学资料。

本项目采用超微结构、免疫组织化学、全基因转录组测序、全基因重测序及微卫星DNA基因分型相结合方法，研究扬子鳄输卵管内精子储存，繁殖期与非繁殖期输卵管的基因表达调控，以及利用亲权分析对每窝卵子代的遗传结构的影响。结果表明，扬子鳄输卵管由分为阴道部、子宫部、峡部、蛋白分泌部、漏斗部五个部位。电镜下，分泌部，子宫部，阴道部分泌泡电子密度排卵前大于产蛋后，支持扬子鳄输卵管不同的部位分泌的不同蛋白可能用于形成卵清蛋白，蛋壳纤维和钙化外壳等。在5月份的子宫部和1月份的蛋白分泌部，观察到精子结构，可能存在精子储存现象。转录组数据分析，扬子鳄繁殖期5月份和冬眠期1月份对比，有2286个显著上调的基因和2378个显著下降的基因； 5月份的输卵管和7月份的输卵管相比，有64个显著上调基因，有48个显著下调基因。差异基因主要集中在PPAR过氧化酶增殖体激活扬子鳄输卵管繁殖期和非繁殖期的结构及生理条件变化。. 利用微卫星DNA对50窝饲养扬子鳄卵（755枚）（非损伤取样）进行了亲权分析，发现有60%具有多父现象，其中52%的窝为“一雌二雄”，8%的窝具“一雌三雄”，“一雌三雄”也是本次对于扬子鳄交配体系研究的新发现；数据显示，多父性并不能显著性增加扬子鳄的产蛋量，并且窝仔数和父亲个数二者之间相关性不显著（P>0.05）。与一夫一妻相比，具有一妻多夫交配体系的雌性扬子鳄更倾向于选择与其亲缘关系更远的雄性。多父性还可降低近交系数，增加后代等位基因的多态性，表明多父性交配体系可作为维持扬子鳄种群遗传多样性的适应对策；. 全基因组重测序的1806694个SNP位点分析表明，扬子鳄多父性能够增加后代的遗传多样性；基因经注释富集后筛选出不同交配体系下的差异基因，包括参与免疫信号的模式识别受体TLR3、调控沙门氏菌对上皮细胞入侵的ARPC3等15个基因，它们与扬子鳄的疾病、免疫以及重要的生命活动息息相关。因此，多父性是一种较为有利的适应对策，对维持种群遗传多样性和增加后代的抗病能力的可能性等方面发挥着重要作用。