酿酒酵母芳香醇脱氢酶家族的功能、进化及其在杂醇合成通路中的地位

In silico analysis reveals the existence of seven putative aryl-alcohol dehydrogenase (AAD) genes in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. This gene family, as well as other several candidate genes, has been implicated to catalyze the final step of the Ehrlich Pathway. Through the Ehrlich Pathway, the aromatic amino acids are converted to fusel alcohols that play key roles in determining the aromatic/flavour profile of fermented foods and beverages. To clarify details of the Ehrlich Pathway, and to thoroughly explore the biological relevance of this subtelomeric gene family, we decide to: (1) purify and characterize the biochemical properties of Aad proteins; (2) analyze the proteomic and transcriptomic behavior of the budding yeast that is challenged with overdosed aromatic amino acids and other toxic keto metabolites; (3) explore phenotype of yeast trains in which Aads are deleted or overexpressed; (4) explore the phylogenetic relation of laboratory, commercial and other sub-ecological strains, and to build relationship between "mutation of gene", "changes of kinetics properties" and "adaptations to eco-niche". These combined biochemical, genetic, proteomic, transcriptomic and in silico analysis would provide knowledge to regulate fusel alcohol formation, as well as to decipher the mystery of this subtelomeric gene family.

酿酒酵母通过Ehrlich Patway将苯丙氨酸等五种芳香族和脂肪族氨基酸代谢为2-苯乙醇等相应的杂醇，这些杂醇在酵母发酵食品/饮品的风味品质构成中起决定性作用。研究表明，酿酒酵母的七个预测芳香醇脱氢酶（AAD）是催化Ehrlich通路最后一步反应的关键候选基因；然而由于该家族基因全部位于高度可塑和快速进化的染色体近端粒区，其相关的生物学功能至今缺乏系统的研究。本研究从刻画七个AAD的编码蛋白的生物化学特征入手，分析该家族及相关脱氢酶同工酶家族在Ehrlich代谢物及醛酮类代谢物挑战下的转录、翻译及酶动力学特征，研究Aad组合敲除/过表达株系在Ehrlich代谢及毒性醛酮代谢物挑战下的适应性，通过实验及生物信息分析方法收集现有条件下可获得的大量亚生态株系，建立这些株系间"基因突变-酶底物亲和性动力学特征改变-环境适应性"的相关性，全面探讨该家族在杂醇合成及小生态快速适应性中的生物学意义。

酿酒酵母是首个全基因组得到完整测序的真核生物，研究和揭示预测基因的生物学意义是后基因组时代的主要科学问题之一。然而酿酒酵母全基因组测序整整20年来，科学界对这个极简的模式真核生物基因组到底拥有多少个功能基因仍不能确定。预测的芳香醇脱氢酶（AAD)大家族是这一不确定性的典型代表，其中一个重要原因是该家族的七个成员全部位于相应染色体的近端粒区，该区域的大部分基因具有高度可塑性和极高的进化速率，这一遗传学特征导致其确切的生物学意义难以捕捉。研究和揭示这组近端粒区多基因家族的生物学功能之谜是本项目所要回答的主要科学问题。.本研究从刻画预测AAD的编码蛋白主要生物化学功能入手，通过相关基因群的定点敲处、酶活性位点的突变、醛酮效应物和Erlich氨基酸不完全代谢途径的代谢组与转录组、全基因组的工程进化等角度研究了该家族迷一般的生物学功能与进化轨迹。主要结果如下：.1.首次完整的刻画了酶学委员EC 1.1.1.90氧化还原酶会芳香醇脱氢酶目前唯一一个可用标准酶PcAAD1。.2.从酿酒酵母实验菌株BY4741克隆了全部七个预测的AAD蛋白编码框，并将其分别采用原核（大肠杆菌）和真核（毕赤酵母、酿酒酵母）表达系统表达与纯化，并对4种辅酶和200个底物进行了酶学特异反应扫描。.（3）证明酿酒酵母AAD4和AAD14具有典型的EC 1.1.1.90活性。AAD4对苯环上3位、4位、5位或多位的取代基的芳香醛的还原具有显著的特异显著性；而AAD14对苯环2位取代基芳香醛具有显著的特异性偏好。这是酿酒酵母AAD生物学活性首次被证实，同时揭示该家族成员的相对功能特异性。.（4）所有其他的预测AAD均不具有活性。对标准蛋白PcAad1p和全部7个酿酒酵母Aad预测蛋白进行了蛋白结构建模与序列分析。认为每一个家族成员的编码框都存在至少一个碱基的缺失或突变，从而导致了编码蛋白关键功能域或催化位点的短截和突变，从而导致功能丧失。.（5）对酿酒酵母基因组现存的全部6个醛酮还原酶和7个醇还原酶进行了组合敲除与功能试验。认为酿酒酵母AAD基因家族是与木质素降解小生态中的祖先酿酒酵母最古老的细胞解毒机制的一部分，但是随着起祖先从相关小生态中的走出以及更高效率的ADH的出现，导致AAD显著功能退化或范化。ADH的出现应晚于酿酒酵母全基因组加倍事件之后。