番茄原位再生中反式玉米素含量变化及miRNA调控机制研究

To date, several miRNAs have already been verified to be involved in phytohormone metabolism and signaling. Phytohormone was recognized as key regulators of plant organogenesis, but there was little report about miRNAs and hormone response, especially in the plant organogenesis without exogenous hormones. Tomato organogenesis system in vivo without exogenous hormones had been established by early work of the project team, and specific expression of trans-zeatin had been verified. This project would use tomato organogenesis in vivo and in vitro, analysis expression variation of trans-zeatin. Then expression variation of miRNA would be analysised by high-throughput sequencing, miRNA involved in trans-zeatin biosynthesis would be characterized via targets prediction. Then the effect of trans-zeatin on miRNA expression would be analysis by applying trans-zeatin and trans-zeatin synthesis inhibitor in tomato organogenesis. Meanwhile, the effect of miRNA on trans-zeatin metabolism and signaling would be analysis by constructing transgenic tomato with miRNA overexpression. Thereby regulatory role between miRNA pathway and trans-zeatin was revealed in plant organogenesis, the reference was provided for further illustrating molecular mechanism of plant regeneration, new insight was brought to cytokinin metabolism research.

目前已有多种miRNA被证实参与植物激素代谢及信号转导。激素是植物再生的重要调控物质，但是关于再生中miRNA参与激素作用的研究报道较少，尤其是不受外源激素干扰的再生体系中的研究尚未见报道。本项目前期工作建立了不需要外源激素的番茄原位再生体系，并证实原位再生中反式玉米素特异性表达。本项目拟以番茄原位再生及离体再生体系为实验系统，确定再生中的反式玉米素含量变化，同时利用高通量测序分析再生中miRNA表达变化，预测靶基因后寻找玉米素相关miRNA。然后在活体再生中施用外源玉米素及玉米素合成抑制剂，分析玉米素对相关miRNA表达的影响；构建玉米素相关miRNA过表达的转基因番茄，分析再生中miRNA对玉米素代谢及信号转导的影响，从而确定番茄再生中miRNA与玉米素的调控关系，为阐明植物再生过程中的miRNA调控机制奠定基础，也为细胞分裂素代谢研究提供新的思路。

miRNAs 是一类短链RNAs，它们介导转录后的基因沉默，从而在植物的生理生化代谢中发挥重要的作用。本项目前期工作建立了不需要外源激素的番茄原位再生体系，该系统是研究植物再生机理的良好实验材料。为了研究miRNAs在番茄活体再生发挥的调控作用，我们利用高通量测序技术鉴定了活体再生中miRNAs的表达谱，随后结合生物信息学和分子生物学实验分析了miRNAs在再生中的表达模式。本研究一共在活体再生过程中鉴定了82个新的miRNAs，18个家族的50个保守的miRNAs，以及27个家族的42个不保守miRNAs。这些miRNAs的靶基因很多被预测为转录因子，其他的靶基因也在代谢过程中发挥重要的作用。值得注意的是，一些靶基因调控植物激素代谢，还有一些靶基因通过调控NAM、GRAS等转录因子调节了植物分生组织的发育，进而影响了愈伤组织的形成和分化。部分显著差异表达的miRNAs通过茎环RT-PCR进行了表达模式的分析，它们的生物学功能正在通过转基因的方法验证。本研究结合高通量测序和分子生物学实验探索了番茄活体再生中miRNAs的表达情况，揭示了活体再生中特异表达的novel miRNA，为阐明植物再生过程中的miRNA调控机制奠定了基础。