长链非编码RNA H19通过调控AMPK影响肌肉胰岛素敏感性的机制研究

Muscle insulin resistance contributes critically to the pathogenesis of major metabolic disorders, including type-2 diabetes mellitus (T2D) and cardiovascular diseases. Highly expressed in muscle, AMPK increases muscle insulin sensitivity and plays a fundamental role in metabolic regulation. Long noncoding RNA H19 is abundantly expressed in skeletal muscle, whereas, its expression is significantly decreased in muscle of T2D patients and insulin resistant rodents. Whether H19 is involved in the regulation of muscle insulin sensitivity and how H19 is downregulated in the diabetic muscle are not clear. Our preliminary data showed that down regulation of H19 in muscle associates with AMPK inactivation, resulting in insulin resistance in H19 knockout mice and C2C12 cell. After analyzing the gene expression profiles of muscle from WT and H19 KO mice using RNA-seq, DUSP27 was found as a target of H19-mediated posttranscriptional regulation and AMPK was identified as a physiologically relevant target of DUSP27. But, the details of the mechanisms need to be further investigated. In this project, we aim to identify the target genes regulated by H19 and explore the mechanism underlying the cause of insulin resistance by a series of in vitro and in vivo experiments. This study will help us to better understand the role of epigenetic mechanisms in regulating insulin resistance and provide therapeutic strategies for T2D.

骨骼肌中发生胰岛素抵抗是2型糖尿病、心血管疾病等代谢类疾病的主要诱因。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）在肌肉中高表达，可提高肌细胞胰岛素敏感性，调控机体能量代谢。长链非编码RNA H19在骨骼肌中特异性高表达，并在2型糖尿病患者与胰岛素抵抗小鼠的肌肉中显著降低，而H19是否在2型糖尿病进程中参与肌肉胰岛素敏感性调控目前尚不明确。通过前期探索实验，我们发现在肌管细胞及H19基因敲除鼠肌肉中，H19下调与AMPK失活和胰岛素抵抗相关，并通过RNA-seq筛选得到中间信号分子双特异性磷酸酶27（DUSP27），我们推测H19可能通过DUSP27影响AMPK活性，最终导致胰岛素抵抗。本项目拟通过一系列体内外实验验证上述假设，明确H19的上游激活通路与下游靶基因，阐明H19调控胰岛素敏感性的分子机制，并从转录后调控和表观遗传学视角完善胰岛素抵抗发生及发展的机制，为2型糖尿病提供新的预防及治疗思路。

项目背景：.骨骼肌中发生胰岛素抵抗，是T2D、心血管疾病等重要代谢类疾病的主要诱因之一。AMPK在肌肉中高表达，可提高肌细胞胰岛素敏感性，并调控机体能量代谢。H19在骨骼肌中特异性高表达，并在T2D患者与胰岛素抵抗的小鼠肌肉中显著降低，而H19在糖尿病进程中参与胰岛素敏感性调控的分子机制尚不明确。..主要研究内容：.本课题旨在阐明在肌肉中LncRNA H19调控AMPK活性，进而影响胰岛素敏感性的分子机制。..实验结果及关键数据：.1）肌肉中H19缺失诱发胰岛素抵抗：肌管细胞敲低H19导致胰岛素应答降低。小鼠敲除H19基因会导致葡萄糖耐量受损，发生胰岛素抵抗的主要部位在肌肉。.2）肌肉中H19缺失导致AMPK活性下降：肌管细胞及H19基因敲除小鼠模型均证实，H19低表达造成AMPK磷酸化水平的降低，进而导致其下游分子乙酰基辅酶A羧化酶总蛋白和磷酸化水平的降低。.3）H19通过miRNA Let-7上调DUSP27的表达：敲减H19可导致DUSP27 mRNA及蛋白水平的下调，H19可通过其靶分子Let-7在转录后水平调控DUSP27的表达。.4）H19通过DUSP27调控AMPK的活性： DUSP27及AMPK均在细胞胞浆中特异性表达，并在空间上存在共定位现象。通过免疫共沉淀实验证实，DUSP27可与AMPK及其信号通路分子形成复合物。H19可以通过Let-7调控DUSP27活性，并进一步对AMPK及其信号通路进行调控。.5）高脂饮食饲养导致小鼠葡萄糖耐量受损，以及肌肉组织中H19和DUSP27的表达下调，进而抑制AMPK及其信号通路的活性。.6）H19参与调控胰岛素抵抗的潜在机制：在糖尿病小鼠模型中，H19可同时受到转录后（糖尿病前期）及表观遗传学（糖尿病后期）的调控，而维持低表达的状态，最终造成胰岛素抵抗。..科学意义：.根据一系列细胞及动物实验，我们得出以下结论：1）在2型糖尿病进展过程中H19表达降低，敲除H19导致胰岛素敏感性降低；2）H19 可通过其靶分子Let-7，在转录后水平下调DUSP27的表达；3）DUSP27可作为分子骨架正向调控AMPK的活性。本项目证实了H19在胰岛素抵抗中的重要作用，可以作为糖尿病以及相关代谢疾病的潜在治疗靶点。