蛋白激酶A介导的μ-钙蛋白酶调节域磷酸化对μ-钙蛋白酶活性的影响机理

μ-Calpain is the key enzyme in postmortem tenderization. Protein kinase A is the most common kinase in catalyzing protein phosphorylation. The previous study of our team found that, phosphorylation of μ-calpain regulatory domain induced by protein kinase A affected μ-calpain activity. However, the specific regulatory mechanism remains unknown. Therefore, the objective of this project is to confirm the effect of protein kinase A phosphorylation on μ-calpain activity and identify the phosphorylation sites in μ-calpain regulatory domain. The overlap PCR technology will be used to mutate the phosphorylation sites in μ-calpain regulatory domain, and the effects of phosphorylation at different sites in regulatory domain of μ-calpain on μ-calpain activity will be investigated. The function of μ-calpain Ca2+-binding domain and catalytic domain regulated by phosphorylation of μ-calpain regulatory domain will be analyzed. The conformation changes of μ-calpain regulatory domain induced by phosphorylating at different sites in regulatory domain and the corresponding conformation changes of μ-calpain Ca2+-binding domain and catalytic domain will be studied. The relationship between conformation changes and the function will be investigated. Above all, the influencing mechanism of phosphorylation of μ-calpain regulatory domain induced by protein kinase A on its activity will be clarified, which will enrich the theory of postmortem meat tenderization mediate by μ-calpain.

μ-钙蛋白酶是宰后肉嫩化的关键酶，蛋白激酶A是最普遍的催化蛋白质磷酸化的激酶，本项目组前期研究表明蛋白激酶A催化μ-钙蛋白酶调节域磷酸化可影响μ-钙蛋白酶活性，但具体的影响机制并不清楚。本项目以宰后骨骼肌μ-钙蛋白酶为研究对象，验证蛋白激酶A催化磷酸化对μ-钙蛋白酶活性的影响，确证蛋白激酶A介导的μ-钙蛋白酶调节域磷酸化位点；利用重叠PCR技术突变μ-钙蛋白酶调节域磷酸化位点并表达，解析调节域磷酸化位点对μ-钙蛋白酶活性的调控作用以及调节域磷酸化对钙离子结合域钙离子结合能力和催化域催化蛋白降解能力的调控作用；研究不同磷酸化位点诱导的μ-钙蛋白酶调节域构象变化及调节域构象变化引起的钙离子结合域和催化域构象的变化，解析构象变化与功能的关系，揭示蛋白激酶A介导的调节域磷酸化对μ-钙蛋白酶活性的影响机理，丰富和发展钙蛋白酶嫩化理论。

嫩度是消费者在购买肉制品时首要考虑的感官特性。μ-钙蛋白酶是宰后肉嫩化的关键作用酶，在宰后肌肉中，μ-钙蛋白酶的活性调控机制十分复杂。研究表明蛋白质磷酸化和亚硝基化影响μ-钙蛋白酶活性，但具体的调控机制并不清楚。因此分析宰后磷酸化对μ-钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白活性的影响，解析钙蛋白酶抑制蛋白磷酸化调控μ-钙蛋白酶活性的途径，分析蛋白质磷酸化和亚硝基化互作对μ-钙蛋白酶降解肌原纤维蛋白作用的影响，对进一步发展蛋白质翻译后修饰调控μ-钙蛋白酶活性的机制具有重要意义。本项目以宰后骨骼肌为研究对象，分析了磷酸化对宰后μ-钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白活性的影响，解析了磷酸化与μ-钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白活性的关系；利用离体模型解析磷酸化通过影响钙蛋白酶抑制蛋白活性调控μ-钙蛋白酶活性的途径，确证了钙蛋白酶抑制蛋白的磷酸化位点；解析了蛋白质磷酸化和亚硝基化互作对μ-钙蛋白酶降解肌原纤维蛋白作用的影响，进一步发展了蛋白质翻译后修饰调控μ-钙蛋白酶活性机制的研究，丰富了钙蛋白酶嫩化理论，为生产高品质肉品奠定了理论基础。