食管癌中ALDOA-K13异常琥珀酰化修饰的功能与分子作用机制研究

We previously found that ALDOA induced the production of high levels of autoantibodies in patients with esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), with the use of serological proteome analysis for identification and a large-scale, multicenter study for validation. This finding implies that ALDOA in esophageal cancer cell might be changed, and might be given some new features besides aldolase in glycolytic pathway. Recently, we applied experiments of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) and Nano-LC-MS/MS, and found that ALDOA is aberrantly succinylated in the site of K13 and that succinylation increases its activity in esophageal cancer cells. However, in esophageal cancer, the functions and molecular mechanisms of aberrant succinylation of ALDOA K13 remain unknown, as well as its role in glycolytic pathway. In this project, based on the establishment of esophageal cancer cell models of K13R succinylation resistant mutant and K13E succinylation mimetic mutant, we will perform a further and systematic study, including molecule level, cell level and experimental animal level, to reveal the function and molecular mechanism of aberrant succinylation of ALDOA K13 in esophageal cancer.

我们以往应用血清蛋白质组分析技术筛选，并通过大样本多中心验证，研究证实ALDOA（糖酵解缩醛酶）能诱导食管癌患者血清中产生高水平自身抗体，提示食管癌组织细胞中的ALDOA蛋白可能发生了某些变化，而且还可能被赋予缩醛酶以外的某种新的功能。最近我们进一步通过纳升级液相色谱串联质谱等实验发现，食管癌中，ALDOA蛋白13位点赖氨酸残基（K13）发生了异常琥珀酰化修饰，且初步证明该修饰可增强ALDOA的酶活性。目前，有关食管癌中ALDOA异常琥珀酰化修饰的功能与分子作用机制如何，是否影响细胞的糖酵解，改变癌细胞的肿瘤生物学行为等诸多新的重要科学问题均不清楚。为此，本项目拟在建立模拟琥珀酰化与非琥珀酰化食管癌细胞模型的基础上，通过采取分子、细胞和整体实验动物三个水平上的实验技术手段，对以上重要科学问题展开深入系统研究，深刻剖析ALDOA-K13异常琥珀酰化修饰在食管癌中的功能与分子作用机制。

我们先前研究发现，ALDOA（糖酵解缩醛酶）能诱导食管癌患者血清中产生高水平自身抗体，并且发现ALDOA蛋白13位点赖氨酸残基（K13）发生了异常琥珀酰化修饰。然而，有关食管癌中ALDOA异常琥珀酰化修饰的功能与分子作用机制等重要科学问题均不清楚。为此，本项目在建立模拟琥珀酰化与非琥珀酰化食管癌细胞模型的基础上，对以上科学问题进行研究，具体结果总结如下：.1）食管癌细胞中，ALDOA-K13琥珀酰化修饰影响其酶活性，促进细胞葡糖糖摄取、消耗和乳酸分泌等，即促进了糖酵解水平；同时，体内和体外实验证明，ALDOA-K13琥珀酰化修饰促进食管癌细胞的分裂增殖和移动，在食管癌中可能发挥促癌功能，表明食管癌中ALDOA-K13琥珀酰化可能使ALDOA发挥着独立于作为糖酵解醛缩酶的功能角色，为后续研究其促癌的分子作用机制提供了实验基础。.2）RNA-seq和生物信息学分析发现，ALDOA和ALDOA-K13琥珀酰化修饰在食管癌中参与多种肿瘤生物分子信号通路，如细胞黏附等；LOXL2及其亚型L2Δ13是ALDOA的相互作用蛋白，能够影响食管癌细胞中ALDOA与F-actin的结合，从而增强其游离性和酶活性；与此同时，ALDOA-K13琥珀酰化修饰同样能够影响F-actin与ALDOA的结合并增强其游离性。.4）ALDOA-K13琥珀酰化修饰在食管癌中高表达，与食管癌患者预后密切相关，是食管癌的独立预后影响因子。这部分成果首次揭示了ALDOA-K13琥珀酰化修饰在食管癌中的临床意义。.5）ALDOA自身抗体联合其它三种自身抗体，建立4-自身抗体组合（ALODA、ENO1、p53和NY-ESO-1），对早期食管癌具有较好的诊断效能；与此同时，ALDOA自身抗体在食管癌患者治疗后水平呈下降状态，提示ALDOA自身抗体可能作为食管癌疗效检测的血清分子标志物。.6）食管癌中ALDOA与IGFBP1、IGFBP2之间的表达存在相关性，并且证实IGFBP1和IGFBP2均在食管癌患者血清中显著高表达，是食管癌潜在的血清早期诊断分子标志物。.总之，ALDOA在传统意义上主要是作为糖酵解途径中的一个酶，然而，我们的研究表明ALDOA-K13琥珀酰化修饰在食管癌中发挥促癌作用，提示ALDOA-K13琥珀酰化可能是食管癌治疗的潜在靶点。