FluG-BrlA途径参与斜卧青霉分生孢子生成和糖苷水解酶合成调控的功能研究

.This research is focused on Penicillium decumbens and its mutant strain which has improved cellulytic enzyme activity and decreased conidiation abillity. Identify the functions of the main transcript factor (FluG, BrlA, and LaeA) and upstream regulation protein using efficient transformation and gene expression evaluation system, and establish the central regulatory pathways of conidiation in P. decumbens. Identify the binding sites of BrlA in genes and analyze its interaction pattern with DNA using the method of chromatin immunoprecipitation assay method and high-throughput sequencing combined (Chip-sequencing). Identify the target protein which has interactions with LaeA using tandem affinity purification (TAP) technique and determine the function of FluG-BrlA pathway during regulation of conidiation and glucoside hydrolases synthesis. Determine damage or low expression genes in the mutant strain.Use the method of overexpression, recomplement of target genes to increase the conidiation ability of mutant without affect its ablility of glycoside hydrolase production.

斜卧青霉是重要的纤维素酶产生菌，传统诱变获得的高产纤维素酶突变菌株伴随有分生孢子形成能力的大幅下降。本课题以斜卧青霉野生株及其高产纤维素酶突变株为研究对象，以丝状真菌分生孢子发生的重要调控蛋白（BrlA、FluG、LaeA）的功能研究切入点，拟利用高效转化和基因评价体系，对参与斜卧青霉分生孢子形成的重要调控蛋白和功能蛋白进行快速功能验证和评价，阐明基因型和表型的关联，建立斜卧青霉孢子发生的中心调控途径；采用染色质免疫沉淀方法和高通量测序手段相结合（Chip-sequencing）的手段，鉴别受BrlA直接调控的靶基因；采用蛋白质串联亲和纯化（TAP）技术，捕捉并鉴别LaeA作用的靶蛋白，并对靶基因和靶蛋白的生物意义进行相关性分析，解析目标蛋白的生物学功能；确定突变株中受到损伤或低表达的孢子发生相关基因，通过基因回补和过表达的方式，在不影响突变株产酶能力的同时，提高其孢子产生能力。

项目以FluG-BrlA途径中核心调控蛋白BrlA，及其上游调控蛋白LaeA的功能研究为切入点，围绕FluG-BrlA途径参与草酸青霉（原名斜卧青霉）分生孢子生成和糖苷水解酶的合成调控展开研究，取得了以下研究成果：.（1）鉴别了受FluG-BrlA途径中核心蛋白BrlA直接调控的靶基因，如转录因子基因abaA、wetA，以及受BrlA间接调控的基因，如色素合成相关基因abrB/yA、arpA，孢子壁疏水蛋白基因rodA、rodB等。对参与FluG-BrlA途径中其它的关键成员，如CK2、Flbs的功能进行了鉴定，构建了草酸青霉孢子形成调控途径的遗传模型，阐明了FluG-BrlA途径既参与草酸青霉无性孢子发生及次级代谢基因簇调控，又调控胞外糖苷水解酶基因转录的重要功能。.（2）阐明LaeA具有与转录调控蛋白共调控孢子发生及胞外糖苷水解酶基因转录的功能。LaeA位于FluG-BrlA途径上游，LaeA与转录调控蛋白CreA的共缺失导致草酸青霉孢子发生能力完全丧失；激活糖苷水解酶基因表达的蛋白如XlnR和ClrB功能的发挥无法绕过LaeA。同时，利用采用蛋白质串联亲和纯化（TAP）技术，捕捉到7个与LaeA相互作用的蛋白，包括与无性孢子生成相关的VeA、 VelB蛋白、与有性生殖相关的RcoA以及组蛋白H2B等，使用双分子荧光互补法证实LaeA与VeA，LaeA与RcoA在核内具有直接的相互作用，推测H2B或许是LaeA发挥甲基转移酶作用的真正靶标蛋白。.（3）发现了新的调控青霉无性孢子生成同时调控胞外糖苷水解酶基因转录的异染色质蛋白HepA。在工业菌株中过表达了hepA基因，孢子产生率较出发株提高约23%；滤纸酶活提高30%。HepA介导的染色质结构的变化表明，hepA缺失后，主要糖苷水解酶基因核心启动子区及其上游的染色质均开放，染色质可及系数显著增加，表明HepA是染色质凝聚所必需。. 以上研究工作所取得的成果具有深刻的科学意义和良好的应用前景：作为种子培养的第一步，工业真菌分生孢子的形成能力对于降低生产成本，控制污染以及菌株保藏至关重要。在本研究中阐明的工业真菌草酸青霉分生孢子形成的调控网络，以及分生孢子和胞外糖苷水解酶形成调控途径中关键调控蛋白（如BrlA、LaeA、HepA）的功能，为菌株的遗传改造提供了合理的改造靶点，具有重要的理论和实践意义。