精子发生中microRNA-184的调控、作用及机制研究

Under the support of National Natural Science Foundation of China, we demonstrated that miR-184 levels were increased during mouse postnatal testis development. Specifically, miR-184 expression was restricted to the germ cells from spermatogonia to round spermatids. Overexpression of miR-184 promoted the proliferation of a germ cell line, GC-1spg. Moreover, miR-184 downregulated nuclear receptor corepressor 2 (Ncor2) by targeting its 3'' untranslated region through inhibiting NCOR2 protein translation. These results were published on a SCI journal. The abstract were awarded "International Travel Award" from American Society of Andrology (ASA) in the Annual Meeting of ASA. and were reported on a national academic meeting. Based on these findings, we wanted to know the mechanism of why miR-184 were expressed specifically in testis germ cells, the in vivo effect of miR-184 and the regulatory mechanism of miR-184 in spermatogenesis. So, this project contains three parts. The first, analyze the promoter of miR-184 gene, demonstrate the testis specific transcription factors which can binding to the promoter of miR-184 gene. The second, develop the miR-184 transgene mice to investigate the effect of miR-184 in spermatogenesis in vivo. The third, identify the target genes of miR-184 in testis.

在青年基金资助下，我们发现miR-184在睾丸中的表达水平具有年龄变化特点，定位于睾丸中生殖细胞；促进GC-1spg细胞增殖；通过抑制其靶基因Ncor2 mRNA的翻译来发挥转录后调控作用。此部分研究结果已发表SCI论文1篇；参加国际会议1次，论文获“Travel Award"奖；参加国内会议1次，论文被选为分会报告。在这些研究工作的基础上我们想进一步了解导致miR-184在睾丸特异表达模式的机制；miR-184在体内的生物学功能及miR-184调控精子发生的机制。因此，本项目拟开展三部分研究工作。第一：miR-184基因启动子分析，确定与miR-184基因启动子区结合的睾丸特异转录因子，从而明确导致miR-184在睾丸特异表达模式的机制；第二：采用构建miR-184转基因小鼠的方法在体研究其功能；第三：通过鉴定与分析睾丸中miR-184的所有靶基因来明确miR-184调控精子发生的机制。

前期研究工作显示miR-184 在睾丸中的表达水平具有年龄变化特点，定位于睾丸中生殖细胞；可促进GC-1spg 细胞增殖；可通过抑制其靶基因Ncor2 mRNA 的翻译在精子发生中发挥转录后调控作用。因此我们想进一步了解导致miR-184 在睾丸特异表达模式的机制；miR-184 在体内的生物学功能及miR-184 调控精子发的机制。因此，本项目开展以下三部分研究工作：确定与miR-184 基因启动子区结合的睾丸特异转录因子，从而明确导致miR-184 在睾丸特异表达模式的机制；采用构建miR-184 转基因小鼠的方法在体研究其功能；通过鉴定与分析睾丸中miR-184 的所有靶基因来明确miR-184 调控精子发生的机制。..我们通过生物信息学方法预测mir-184启动子区可能结合的转录因子，通过RT-qPCR、免疫组化（荧光）法确定与miR-184表达模式一致的转录因子Pax-5与Yy-1；进一步用过表达Pax-5与Yy-1法确定了这两个转录因子可以促进miR-184的表达，提示Pax-5与Yy-1可能调控miR-184在睾丸中的时空特异性表达模式。通过采用受精卵雄原核注射构建miR-184转基因小鼠（Ddx4-Tg-miR-184）。12只首建鼠与野生型小鼠交配，其中只有1只未获得子代小鼠。其余11只首建鼠都可产生子代小鼠。每窝产仔数、附睾精子浓度及精子活动力、睾丸与附睾的组织学切片与对照野生型小鼠相比无显著差异。以上实验说明Ddx5-Tg-miR-184转基因小鼠生殖系统没有出现明显表型。最后我们以Founder93号小鼠的子代雄鼠与WT雄鼠鼠脑组织做表达谱（DGE）测序，在上调的基因中利用miRNA靶基因预测软件确定了miR-184的6个靶基因 。此外，我们检测了miR-184在不育男性患者血清中的表达水平，结果显示miR-184在不育男性患者血清中的表达水平大大下降，提示血清中miR-184的表达水平可以作为衡量男性生育力的可能指标之一。..通过本课题研究，明确了miR-184 在睾丸中呈时空特异表达模式的机制；明确了通过雄原核注射构建的Ddx4-Tg-miR-184转基因小鼠生殖系统没有出现明显表型；筛查出miR-184的6个靶基因；提示血清中miR-184的表达水平可以作为衡量男性生育力的可能指标之一。