基于桔霉素和洛伐他汀的红曲霉代谢规律及调控机理

针对红曲霉代谢产物中主要功能成分- - - - 洛伐他汀产量偏低以及普遍含有真菌毒素- - - - 桔霉素的安全性问题，通过对溶解氧、光照培养条件、发酵温度等环境因子进行红曲霉代谢控制发酵，监控红曲霉不同发酵特性菌株桔霉素、洛伐他汀产量及其编码基因的变化，研究其最佳诱导条件及控制参数；采用抑制性消减杂交技术构建红曲霉差异表达cDNA文库，筛选红曲霉中桔霉素、洛伐他汀的代谢调控关键基因；结合蛋白表达差异、代谢产物分析和受体研究，确定红曲霉产生桔霉素、洛伐他汀调控基因的功能；采用同源重组和农杆菌介导转化的方法敲除红曲霉桔霉素代谢的关键调节基因或洛伐他汀代谢的限速基因，筛选突变体并进行发酵性能测定，获得高产洛伐他汀、不产或低产桔霉素的基因工程菌。该课题不仅可有效解决红曲霉洛伐他汀产量偏低、桔霉素产量过高这一难题，而且为深入研究红曲霉信号传导途径和次生代谢产物调控机理奠定基础。

洛伐他汀是红曲霉的主要次级代谢产物之一，因其具有降胆固醇、降血脂的功效而受到广泛重视；桔霉素也是红曲霉的一种次级代谢产物，因其具有明显的肾毒性，成为红曲霉产业发展的主要障碍。本项目通过研究不同环境因子（不同光照强度、不同光照时间、不同溶氧浓度、不同温度梯度）对红曲霉次级代谢产物（桔霉素及洛伐他汀）产量的影响，确定高产洛伐他汀、低产桔霉素的发酵条件；利用荧光定量PCR技术，结合环境因子对红曲霉次级代谢产物的影响规律进行探索，筛选出红曲霉次级代谢调控基因表达差异最大的诱导条件；对环境因子诱导下相关基因的表达差异进行研究分析，运用高效液相色谱串联质谱电喷雾法（LC-ESI-MS/MS）对不同温度条件下红曲霉菌株蛋白组进行了初步研究；利用基因敲除等技术构建高产洛伐他汀、低产桔霉素的工程菌株。研究结果表明，添加1%柠檬酸时（pH2.84）洛伐他汀产量最高，达到5.21mg/g，桔霉素产量最低，为3.56 μg/mL；低温条件下可以获得更多的洛伐他汀，20℃时洛伐他汀的最高产量比30℃提高了137倍，达2917.67 μg/g干重，但低温也能促进桔霉素生成，因此，发酵条件要选择合适的培养温度；蓝光可以抑制洛伐他汀的产生；限氧条件可以抑制桔霉素的产生。不同温度下，红曲霉产洛伐他汀相关基因簇的表达量不同，mokA、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、MpLaeA基因的表达量与洛伐他汀产量成正相关，mokB、mokH和mokI三个基因与洛伐他汀产量成负相关；不产桔霉素的菌株中，ctnA和ctnE基因缺失；利用LC-ESI-MS/MS检测出2016个蛋白，以30℃培养温度的红曲霉蛋白含量为对照，以蛋白表达量2倍以上的变化为判断指标，发现实验组即20℃培养的红曲霉中，有240个蛋白表达量发生上调，180个蛋白表达量发生下调，mokI基因所编码的外排泵这一蛋白的表达量与mokI基因表达量趋势相同，都发生下调；利用基因敲除技术，成功地对CtnA基因进行了敲除，基因敲除菌株的桔霉素产量仅为原始菌株的6.18%，降低了红曲霉的桔霉素含量。以上研究成果为红曲霉产业的发展奠定了一定基础。