DT-13基于NMIIA—EGFR/C2GnT-M—HKII联合TPT调节肿瘤有氧糖酵解抗胃癌作用机制研究

Aerobic glycolysis is the main characteristic of energy metabolism for tumor. Therefore, regulation of aberrant energy metabolism is a novel strategy for cancer treatment. In consideration of TPT suffered restriction because of the serious toxicity, DT-13 which is derived from Liriope muscari (Decne.) Baily showed the synergistic effect with TPT by the apoptosis induction of gastric cancers via Non muscle myosin IIA/Epithelial growth factor receptor pathway. Furthermore, the metabonomics suggested that DT-13 also could regulate aerobic glycolysis to enhance the anticancer effect of TPT. Thus, this study plans to explore the mechanism of the drug combination by EGFR-dependent NMIIA-EGFR-HKII axis and EGFR-independent NMIIA-C2GnT-M-HKII axis, in molecular level, cellular level and animal level. On the one hand, we want to investigate the effect of 4 functional domains of NMIIA on glycosylation of HKII. On the other hand, we prepare to understand the 4 functional domains of NMIIA affected by DT-13. In brief, our study will provide a novel strategy to resolve the toxicity of TPT and promote the drug development of DT-13.

有氧糖酵解是肿瘤能量代谢的主要特点，调节异常能量代谢是治疗肿瘤的新方向。拓扑替康（TPT）具有一定毒副作用，临床应用受限。DT-13为短葶山麦冬中分离得到的单体皂苷，申请者前期工作表明DT-13通过NMIIA-EGFR途径增强TPT促胃癌细胞凋亡；体内代谢组学研究发现DT-13可通过抑制有氧糖酵解，协同TPT发挥抗胃癌作用。本课题拟从分子、细胞、整体动物水平，深入研究DT-13联合TPT通过EGFR依赖型NMIIA-EGFR-HKII轴及EGFR非依赖型NMIIA-C2GnT-M-HKII轴抗胃癌有氧糖酵解作用机制；从有氧糖酵解入手，以NMIIA为研究对象，探讨NMIIA 各功能区域对HKII糖基化的作用；探讨DT-13对NMIIA的Motor、Neck、Coiled-coil rod和NHT 4个功能区域的作用；为解决TPT临床毒副作用提供新思路；对DT-13的研究开发具有十分重要的意义

DT-13属于弱效抗肿瘤天然单体，但在与其他药物联合抗肿瘤的研究中，发现DT-13能显著增强已上市的抗肿瘤药物（如TPT、顺铂、紫杉醇等）对肿瘤细胞的增殖抑制作用。本项目结合体外细胞实验、体内裸小鼠实验及体内代谢组学分析对DT-13联合TPT进行了大量的药效学研究，证实了DT-13联合TPT能协同抑制胃癌细胞有氧糖酵解。随后，从分子、细胞、动物模型、代谢组学等不同层面，详细地阐明了DT-13联合TPT抑制胃癌细胞有氧糖酵解作用的作用机制。同样在一定程度解决TPT临床应用受限的问题。 首先，在药效学层面，利用体内代谢组学分析实验结合WB、PCR实验，证实DT-13联合TPT在体内BGC-823裸小鼠原位移植瘤模型中发挥协同抑制有氧糖酵解的作用。又在体外细胞水平上利用糖酵解相关试剂盒检测及WB、PCR实验进一步证实了DT-13联合TPT可以抑制葡萄糖的摄取、抑制乳酸的生成，协同发挥抑制人胃癌细胞BGC-823有氧糖酵解的作用，与体内代谢组学分析数据相一致。其次，在机制层面，通过WB、PCR实验筛选，发现NM IIA敲除后，DT-13联合TPT对 HK II的下调作用被逆转，进而确定DT-13联合TPT，通过靶向NM IIA，进而影响到HK II。利用EGFR特异性抑制剂、EGFR下游经典通路抑制剂方法也证实了EGFR下游MEK通路、PI3K通路对HK II的转录因子CREB的调控作用。实验结果表明，DT-13联合TPT通过靶向NM IIA，促进EGFR介导的泛素化降解，进而抑制EGFR下游p-ERK、p-AKT水平及其入核能力，抑制CREB的活性，抑制HK II启动子的活性，最终抑制有氧糖酵解. 另外，体内瘤组织的WB、免疫组化的结果也都证实了DT-13联合TPT的体内的作用机制与体外的作用机制相一致。最后，计算机分子对接、SPR实验、BLI实验等结果证实DT-13与NMIIA头部蛋白有结合。但是，通过计算机预测的18个可能的氨基酸位点均不是DT-13与NM IIA头部的结合位点，具体的结合位点有待进一步研究。