应用mRNA在实体肿瘤细胞中表达多细胞因子介导肿瘤靶向免疫治疗及其机制研究

Research in precision medicine andimmunotherapy has enabled the development of therapies that provide significant benefit to cancer patients, but the benefit only in a fraction of patients; the limitations are patient does not develop tumor specific T cell immune responses, or the tumor specific T cell can not reach the tumor microenvironment. This study is to discover and develop novel mRNA-based cancer immunotherapy, by intratumoral injection effectively delivers mRNA and leads to robust local cytokines (IL-2, IL-15, IFN-α, GM-CSF, IL-12, FLT3L, 41BBL) or cytokines combinations expression, modulating various stages of cancer immunity cycle, induce a durable long-lasting augmented tumor specific T cell immune responses, develop a curative precision immunotherapy for the majority of cancer patients.

近年来开展了大量肿瘤靶向治疗和免疫治疗的研究，机体缺乏肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），或实体肿瘤微环境内只有少量肿瘤特异性CTL浸润是影响肿瘤免疫治疗效果的主要因素。在肿瘤-免疫循环中，多种细胞因子参与调节肿瘤免疫反应，包括抗原提呈细胞的趋化、聚集及肿瘤抗原捕获和提呈，以及肿瘤特异性CTL激活、诱导、增殖和对肿瘤细胞的杀伤。本研究旨在运用近年来新发展出的体外转录（IVT）mRNA，注射入动物模型实体肿瘤，在肿瘤细胞表达IL-2、IL-15、IFN-α、GM-CSF、IL-12、FLT3L、41BBL等细胞因子或多种细胞因子组合，于肿瘤局部靶向性形成持久高浓度细胞因子，促进实体肿瘤微环境内肿瘤-免疫循环的发生，激活、诱导、增强并产生持久性肿瘤特异性细胞免疫反应，实现肿瘤靶向性免疫治疗的新途径。

近年来开展了大量肿瘤靶向治疗和免疫治疗的研究，机体缺乏肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），或实体肿瘤微环境内只有少量肿瘤特异性CTL浸润是影响肿瘤免疫治疗效果的主要因素。在肿瘤-免疫循环中，多种细胞因子参与调节肿瘤免疫反应，包括抗原提呈细胞的趋化、聚集及肿瘤抗原捕获和提呈，以及肿瘤特异性CTL激活、诱导、增殖和对肿瘤细胞的杀伤。本研究旨在运用近年来新发展出的体外转录（IVT）mRNA，注射入动物模型实体肿瘤，在肿瘤细胞表达细胞因子或多细胞因子组合，于肿瘤局部靶向性形成持久高浓度细胞因子，促进实体肿瘤微环境内肿瘤-免疫循环的发生，激活、诱导、增强并产生持久性肿瘤特异性细胞免疫反应，实现肿瘤靶向性免疫治疗的新途径。首先，构建了IL-2、IL-15、GM-CSF、IL-12b、IL-12a1、IFN-a1、FLT3l、4-1BBL等细胞因子的表达质粒，体外培养细胞水平验证了表达效果，动态趋势分析发现质粒可高表达至少6天。以IL-2为代表注射B16黑色素瘤C57BL/6小鼠模型，结果发现CD3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD56阳性肿瘤浸润淋巴细胞表达升高。接着在B16黑色素瘤C57BL/6小鼠模型筛选出了最佳细胞因子组合IL-2、IL-15、GM-CSF和IFN-a1。然后合成了最佳细胞因子组合的mRNA，WB结果验证合成的mRNA可在体外培养细胞表达蛋白，且可维持5天。接着在B16黑色素瘤C57BL/6小鼠模型上探讨了最佳细胞因子mRNA组合抑瘤效果，免疫组化结果发现可使CD3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD56阳性肿瘤浸润淋巴细胞显著增多，流式细胞及ELISA结果检测血液及脾脏，发现在肿瘤局部微环境中mRNA组合有效增强、活化并产生了肿瘤特异性CTL，肿瘤特异性CTL分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α增多，显著抑制了肿瘤组织的生长。最后发现，最佳细胞因子组合mRNA可诱导较强的过继免疫治疗效应，可显著抑制B16黑色素瘤C57BL/6小鼠模型肿瘤生长，可显著抑制BALB/c裸鼠体内成瘤。本研究发现实体瘤注射多细胞因子mRNA可有效抑制肿瘤，为mRNA药物肿瘤免疫治疗的研究提供了初步的理论及实验基础。