基于酶法修饰的茶叶多糖结构特征及免疫活性机制研究

茶多糖是天然大分子，其活性与结构密切相关。本课题采取酶法修饰茶多糖，修饰茶多糖结构，提高其生物活性，研究茶多糖结构与免疫活性变化关系的作用机制。基于前期研究结果，选择2种糖苷酶作为工具酶，对茶多糖进行结构修饰，并采取能满足生产条件的膜分离技术，对茶多糖按分子量进行适当划分，选择体外活性指标作为修饰适度参考指标，优化筛选制备高活性茶多糖的酶法修饰条件；对修饰改性前后的茶多糖进行结构分析，运用IR，GPC-LLS，GC-MS，NMR,CD,AFM,SEM等仪器比较分析酶法修饰对茶多糖结构的影响；结合动物实验与细胞生物学实验，研究修饰前后茶多糖免疫活性以及对免疫相关细胞因子的影响。结合酶法修饰茶多糖的结构和功能的变化，探索茶多糖结构与其免疫活性间的构效关系机制。

本课题利用糖苷酶对绿茶多糖进行酶法修饰改性，以茶多糖清除几种自由基的能力大小为评判指标，结合单因素与正交实验，得到绿茶多糖酶法水解的优化条件为：酶水解温度35℃，多糖浓度5mg/ml，水解时间30min和酶浓度为设定值1。通过酶法水解改性后的茶多糖，体外清除自由基能力有了显著提高，ETPS与TPS相比较，在清除羟基自由基能力方面较后者提高49％，清除超氧阴离子能力方面提高33％。进一步结合动物模型研究茶多糖对免疫低下模型小鼠的免疫功能发现，TPS与ETPS在免疫低下模型小鼠的细胞免疫功能，体液免疫功能，单核－巨噬细胞功能和NK细胞活性4个方面的实验中，结果均呈阳性，说明它们均具有明显的增强免疫功能的作用，其作用途径一方面促进免疫器官的修复，另一方面通过增强巨噬细胞、T淋巴细胞、NK细胞的活性和通过体液免疫途径来实现。试验结果还表明，酶法水解能显著提高绿茶多糖的免疫活性。对存在活性差异的茶多糖样品进行结构比较分析发现，对同一来茶样提取的ETPS2-1中性糖含量低于TPS2-1，糖醛酸含量高于TPS2-1，都具有糖缀合物的特性。TPS2－1的相对分子，分散系数均高于ETPS2-1，单糖组成种类相同但比例存在较大差异。利用粘度测定、GPC-LLS、CD、AFM、SEM、以及热特性分析技术研究绿茶多糖酶法水解前后高级结构的变化。结果表明，TPS2-1与ETPS2-1在溶液中的分布都是不均一的，粘度均很低。AFM观察结果表明，TPS2-1多糖分子呈链状结构和分枝叶片状，而ETPS2-1糖分子呈现一些比较规则的圆盘状，圆盘上均匀聚集颗粒状物质。经过改良后的扫描电镜（SEM）观察结果表明，TPS2-1表面光滑，呈现一种片层状形态。ETPS2-1由小颗粒聚集形成规则的片状形态，但没有堆积聚集现象，颗粒状分子排列紧密，呈平铺状态。利用CD、AFM、SEM方法深入分析酸碱情况下多糖微观形貌,发现酸碱环境都引起TPS2-1与ETPS2-1多糖分子构象发生显著变化，呈现酸性环境促进多糖分子的分散，碱性环境则促进分子的聚集的趋势。这种溶液行为和微观形貌的变化对活性有显著影响。还发现不同金属离子与酶法水解前后茶叶多糖的络合效应与抗氧化活性。而Mn2＋、Zn2＋离子显著增强了茶叶多糖的抗氧化活性。利用金属离子与茶叶多糖的配位络合效应能设计出高活性茶叶多糖的优势构象。