单分子研究转录因子和抗生素作用肺结核杆菌RNA聚合酶转录延长动力学机制

Tuberculosis is one of the most common and deadliest infectious diseases, and Mycobacterium tuberculosis RNA polymerase is the validated target for antibiotics to be against tuberculosis disease. Antibiotic rifampin is a tremendous breakthrough in the current treatment of tuberculosis from 1960’s. But rifampin-resistant strains came out and pose an urgent public-health crisis. It is vital and urgent to develop new antibiotics to avoid the development of resistance. Here we will study the dynamic mechanism of transcription elongation by Mycobacterium tuberculosis RNA polymerase to provide a scientific strategy for the treatment of tuberculosis..Based on single molecule optical tweezers and single molecule fluorescence resonance energy transfer techniques, we will characterize the dynamics of transcription elongation by Mycobacterium tuberculosis RNA polymerase and its comparison to Escherichia coli RNA polymerase, compare the different mechanisms between wild-type and rifampin-mutants, study the mechanism of transcription factor CarD, and understand the effect of antibiotic PUM on transcription elongation. .The experiments have permitted for the first time to extract the full molecular trajectories of Mycobacterium tuberculosis RNA polymerase and single molecular conformation changes, and it will help to gain molecular insight into the unknown dynamic mechanisms of transcription by Mtb RNAP and the modulation by transcription factor and antibiotic, for providing a scientific guidance of understanding how Mtb RNA polymerase works.

肺结核是最普遍、最致死的传染病之一，肺结核杆菌RNA聚合酶是抗生素对抗肺结核病的有效靶点。从20世纪60年代开始，抗生素利福平是当前治疗肺结核疾病的重大突破。但随后抗利福平耐药株的出现引发了紧急公共卫生危机。开发新的抗生素以避免耐药性的持续发展变得至关重要。.我们将通过单分子光镊和单分子荧光共振能量转移技术进行肺结核杆菌RNA聚合酶的转录延长动力学机制研究。实验将表征肺结核杆菌RNA聚合酶的转录延长特性，并与大肠杆菌RNA聚合酶的特性进行比较。同时比较野生型和抗利福平突变体之间的不同转录延长机制，研究转录因子CarD作用RNA聚合酶的机制，并了解抗生素PUM对转录延长的影响。.实验将首次给出肺结核杆菌RNA聚合酶的单分子动力学全轨迹曲线以及单分子构象改变，从分子视角帮助洞察肺结核杆菌RNA聚合酶未知的转录延长动态机制，试图为结核病的治疗和抗生素的发展提供科学策略。

结核病是由单一传染性病原体结核分枝杆菌引起，是最常见和最致命的传染病之一。结核分枝杆菌RNA聚合酶是抗生素治疗结核病的主要靶点。深入了解结核分枝杆菌RNA聚合酶及其对不同抗生素的反应至关重要，这能为治疗结核病提供具体的科学信息。在本研究中，我们从抗生素抑制转录延长的分子机制、结核分枝杆菌RNA聚合酶转录终止的动力学以及转录因子CarD的分子调控三个方面研究了转录的单分子动力学。. 利用光镊方法表征了结核分枝杆菌RNA聚合酶转录延长的动力学和三种相对较新的抗生素AAP、STL和PUM的分子抑制机制。我们还使用大肠杆菌RNA聚合酶的反应作为参考点，发现二者的不同之处。结核分枝杆菌RNA聚合酶有大肠杆菌RNA聚合酶一半的有效延长速率，这表明——与大肠杆菌相比，结核分枝杆菌发现的体内较慢的总转录率，在没有转录因子的情况下仍是这样。结核分枝杆菌RNA聚合酶也被发现与大肠杆菌RNA聚合酶一样稳健，但其暂停效率与大肠杆菌RNA聚合酶不同。此外，结核分枝杆菌RNA聚合酶对不同的药物有不同的反应。AAP的抑制有两种不同的模式；STL使结核分枝杆菌RNA聚合酶偏向倒退；PUM增加了大肠杆菌RNA聚合酶的暂停密度，但却将结核分枝杆菌RNA聚合酶转换为两个慢速状态。. 通过使用光镊，我们表征了结核分枝杆菌RNA聚合酶的动态转录终止，以理解结核分枝杆菌的终止机制，这与大肠杆菌终止机制不同。单个RNA折叠轨迹提供了直观的生物物理视角来理解RNA折叠如何影响结核分枝杆菌RNA聚合酶的转录终止，实时轨迹显示结核分枝杆菌RNA聚合酶在转录终止区的脱落、通读和暂停三个特征。. 应用单分子荧光共振能量转移监测结核分枝杆菌RNA聚合酶释放转录因子CarD的分子动力学。记录的单分子荧光共振能量转移轨迹反映了Cy3标记的GreA和Cy5标记的CarD之间的动态相互作用，这表明当GreA与结核分枝杆菌RNA聚合酶结合时，转录起始因子CarD要么发生构象变化，要么从转录起始复合物中释放出来。这种现象提供了转录因子CarD在转录早期从结核分枝杆菌RNA聚合酶释放的潜在原因。