苦荞麦胰蛋白酶抑制剂对番茄早疫病抑制效应的分子机制

It is well known that protease inhibitors can suppress numerous plant pathogenic fungi, however, little is known about the antifungal mechanism of protease inhibitors. A major trypsin inhibitor(FtTI) was isolated and characterized from the seeds of the tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum) by ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography and centrifugal ultrafiltration. The gene of the trypsin inhibitor of tartary buckwheat (FtTI) was successfully cloned, expressed in Pichia pastoris and tested for inhibitory effects on mycelial growth and spore germination. To reveal the mechanism that the FtTI inhibit phytopathogenic fungi growth, in this proposal, we will investigate the inhibitory effect that FtTI repress protease and α-amylase of phytopathogenic fungi. We will research the desductive effect that FtTI damage the ultrastructure of cell walls, membranes and mitochondrion of plant pathogenic fungal as well as fungal DNA replication, transcription and translation by physiological and biochemical parameters detection, fungal cell ultrastructure changes observation, subcellular localization, DNA and protein interactions and protein interactions. This stusy will bring new insights into understanding plant defense mechanism and promoting the development of resistance breeding. It is also of great significance to reveal the molecular mechanism of interactions between FtTI and plant pathogenic fungi and to open up a new avenues for the development of environmentally safe and harmless green fungicide reagents.

植物蛋白酶抑制剂可以抑制多种植物病原真菌的生长，但其抗病机理尚不清楚。前期研究中，本课题组应用离子交换层析、亲和层析和离心超滤技术纯化了苦荞麦胰蛋白酶抑制剂（FtTI），克隆和表达了高抗植物病原真菌的FtTI基因，其编码的抗真菌蛋白对多种植物病原真菌有很强的抑制作用，能显著抑制菌丝的生长和孢子的萌发。本项目拟采用生理生化指标测定、菌体细胞超微结构变化观察、亚细胞定位、DNA与蛋白质相互作用，蛋白质与蛋白质相互作用，明确FtTI对番茄早疫病分泌的蛋白酶和α-淀粉酶的抑制作用，对番茄早疫病菌细胞壁、细胞膜和线粒体超微结构的影响以及对番茄早疫病菌DNA复制、转录和翻译等方面的影响，揭示FtTI抑制植物病原真菌的作用机理。这对于进一步了解植物的防御机制，推动抗病虫育种向深层次发展具有重要意义；并有利于从分子水平揭示蛋白酶抑制剂与植物病原真菌相互作用的分子机制，为研制对环境安全无害的绿色杀植物病原真

植物蛋白酶抑制剂可以抑制多种植物病原真菌的生长，但其抗病机理尚不清楚。前期研究中，本课题组应用离子交换层析、亲和层析和离心超滤技术纯化了苦荞麦胰蛋白酶抑制剂（FtTI），克隆和表达了高抗植物病原真菌的FtTI基因，其编码的抗真菌蛋白对多种植物病原真菌有很强的抑制作用，能显著抑制菌丝的生长和孢子的萌发。本项目采用生理生化指标测定、菌体细胞超微结构变化观察、亚细胞定位、DNA与蛋白质相互作用，蛋白质与蛋白质相互作用，明确FtTI对番茄早疫病分泌的蛋白酶和α-淀粉酶的抑制作用，对番茄早疫病菌细胞壁、细胞膜和线粒体超微结构的影响以及对番茄早疫病菌DNA复制、转录和翻译等方面的影响，揭示FtTI抑制植物病原真菌的作用机理。结果发现FtTI 破坏了菌体细胞的形态，导致菌悬液中相对电导率升高和核酸的泄漏，影响了番茄早疫病菌膜的通透性；通过荧光显微镜观察和导电率测定发现，50 mM的FtTI使菌体细胞膜的完整性遭到破坏并促进胞内 ROS 的产生，造成了菌体细胞膜的氧化损伤；酵母双杂交和GST pull-down等方法证明FtTI对菌体分泌的蛋白酶的活性表现出很强的抑制作用。通过实验得出FtTI可能通过这种多靶点协同增效作用达到其抑菌效果。这一研究结果对于进一步了解植物的防御机制，推动抗病虫育种向深层次发展具有重要意义；并有利于从分子水平揭示蛋白酶抑制剂与植物病原真菌相互作用的分子机制，为研制对环境安全无害的绿色杀菌剂也开辟了新的途径。