Nrf-2/ARE信号通路在一氧化碳中毒脑损伤中的作用机制及靶向治疗的可行性研究

It is well known that apoptosis and oxidative stress play an important role in the pathogenesis of brain injury and delayed encephalopathy after carbon monoxide（CO) poisoning. Our previous study indicated that the number of apoptosis cells increased significantly and the expression levels of heme oxygenase-1 (HO-1) and nuclear factor erythrocyte two related factors-2 (Nrf-2) proteins decreased obviously in brain tissue in rats after CO poisoning. The application of antioxidants could reduce apoptosis and increase HO-1 and Nrf-2 protein expressions and attenuate significantly brain injury induced by CO poisoning. In this study, the cortical neurons will be transfected by lentivirus carrying enhanced green fluorescent protein (LV-EGFP) and Nrf-2 gene (LV-Nrf-2) at different multiply of infection (MOI) values. With the use of recombinant lentivirus transfection and gene knockout technology, we aim to observe the expression changes of Nrf-2/ARE (antioxidant response element) signaling pathway molecules（HO-1、NQO1、GSH、Trxs) in neurons in vitro and in vivo and the tolerance to CO poisoning in brain tissue with over-expression or zero expression Nrf-2 gene, further elucidate the mechanism of Nrf-2/ARE signaling pathway in brain damage and the treatment feasibility of exogenous and endogenous Nrf-2 gene for CO poisoning, so as to provide theoretical basis for targeted therapy of acute CO poisoning.

细胞凋亡和氧化应激损伤在一氧化碳（CO）中毒后脑损伤及迟发型脑病的发病机制中发挥重要作用。我们前期研究表明，大鼠CO中毒后脑组织中神经细胞凋亡明显增加，血红素加氧酶-1（HO-1）及核转录因子红细胞2相关因子-2（Nrf-2）表达水平明显下降，应用抗氧化剂能减少细胞凋亡、增加HO-1及Nrf-2蛋白表达，改善CO中毒后脑损伤。本研究将携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）或Nrf-2基因的慢病毒分按不同的MOI转染皮质神经元，协同基因敲除技术，在体外、体内观察Nrf-2/ARE（抗氧化反应元件）信号通路相关分子（HO-1、NQO1、GSH、Trxs）在神经细胞中的表达改变，及过度表达或零表达Nrf-2基因大鼠脑组织对CO中毒的耐受性，探讨Nrf-2/ARE信号通路在CO中毒后脑损伤的作用机制，明确外源性及内源性Nrf-2基因或蛋白对CO中毒脑损伤治疗的可行性，为靶向治疗急性CO中毒提供依据。

一氧化碳（CO）中毒在日常生活及临床上十分常见。CO中毒可引起多种神经病理学改变，如急性脑损伤和迟发型脑病，严重影响患者的预后及生存质量。目前认为，CO中毒引发的脑损伤可能与神经细胞凋亡、细胞能量代谢障碍、脂质过氧化、脑微循环障碍、血脑屏障（BBB）结构和功能受损、兴奋性氨基酸的毒性作用等有关，其中，氧化应激损伤和细胞凋亡在急性CO中毒脑损伤的发病机制中发挥重要作用。Nrf2是迄今研究最为重要的Nrf2/ARE通路中的关键信号分子，其活性状态直接调控机体的抗氧化能力。本研究利用高压氧舱吸入法成功制作急性CO中毒大鼠模型，在脑立体定位仪下给予脑内局部注射负载Nrf2基因的慢病毒，以丁苯酞、莱菔硫烷为药物对照，以CO中毒大鼠为中毒对照，以正常大鼠为正常对照，结果发现：正常对照组大鼠脑组织中存在少量凋亡细胞，正常神经元核大而圆，线粒体丰富，双层膜结构完整，线粒体嵴排列整齐，突触结构清晰、完整。CO中毒组大鼠脑组织中神经细胞凋亡明显增加，神经细胞核皱缩、变形，染色质聚集、边缘化，线粒体肿胀，线粒体嵴排列紊乱，突触结构不清晰。Nrf2基因治疗后，大鼠脑组织中凋亡细胞较CO中毒组减少，神经细胞核形态大致正常，线粒体体积、数目及形态较CO中毒组明显改善，突触结构大致正常。正常对照组大鼠脑组织中神经细胞线粒体膜电位维持相对恒定，脑组织中可见Nrf2蛋白低水平表达。CO中毒组和空载慢病毒组大鼠脑组织神经细胞线粒体膜电位明显下降，Nrf2及其下游基因，如HO-1, TRX, SOD,CAT GCLC等蛋白能暂时性激活，提示机体面临CO中毒时，能启动自身防御机制，但这种防御机制作用时间短，作用效果轻微。Nrf2治疗组大鼠脑组织神经细胞MMP也有下降，但明显高于同一时间点CO中毒组及空载慢病毒组(P＜0.05)；脑组织中Nrf2、HO-1, TRX, SOD蛋白的表达明显增高，脑损伤程度明显减轻，说明：急性CO中毒早期，用人工方法靶向调节Nrf2基因的活性，进而激活Nrf2/ARE信号通路，有助于促进CO中毒急性脑损伤功能的恢复。