补充牛乳铁蛋白对早产鼠肠道粘膜组织的影响及机制

Bioactive milk proteins may be important in protecting preterm infants from developing inflammation and necrotising enterocolitis (NEC). We hypothesize that the bioactive effects associated with bovine lactoferrin (bLF) in milk or formulas may potentially prevent excessive inflammatory responses and the risk of NEC development in immature preterm neonates. A preterm rat model will be used to investigate the protective effects of enteral bLF against NEC development and inflammation. The cell NEC model will be made by isolated cultured intestinal epithelial cells and incubate with lipopolysaccharide(LPS). We will measure the blood and intestinal tract LF levels and to determine the changes after supplementation of bLF in the experimental NEC of preterm newborn rats. We will investigate the mechanisms of bLF on cell proliferation, pro-inflammatory cytikone release as well as the mediation of MAPKs-ERK, NF-κβ and HIF-1α intracellular signaling pathways. In this study, ELISA, qRT-PCR, WesternBlot, immunofluorescence and other techniques will be used to detect the key signal factors such as ERK, NF-κβ and HIF-1α. Compared with conventional NEC therapy, enhancement of anti-inflammation and antimicrobial activities by bLF, in theory, has the advantage of effectiveness against a broad spectrum of even antibiotics-resistant microbes. This approach could therefore be a successful strategy to be selected for prevention and controlling serious NEC in further animal and clinical studies in the future.

乳铁蛋白（LF）为母乳中的生物活性蛋白，在保护早产儿发生坏死性小肠结肠炎（NEC）中发挥着重要作用。研究表明，MAPKs-ERK是调节肠道细胞再生的重要信号通路，牛乳铁蛋白（bLF）可以活化MAPKs-ERK，也可以使对肠道起保护作用的抗炎因子的表达增加。我们推测，LF和肠上皮细胞表面受体结合，可能通过激活MAPKs-ERK信号通路促进细胞再生，增加保护性炎症因子的合成发挥作用的。所以，本课题拟以早产新生大鼠为主要研究对象，结合体外肠道上皮细胞培养，建立NEC的动物模型和细胞模型，应用ELISA、qRT-PCR、WesternBlot和免疫荧光等技术， 深入研究早产儿鼠血浆及肠道内LF的水平，补充bLF对肠道上皮细胞发育、再生和分化的影响；研究bLF对早产儿大鼠肠道上皮细胞MAPKs-ERK、NF-kβ和HIF-1α信号通路的调控作用，明确bLF的作用机制及靶点。从而为补充bLF促进肠道粘膜发育、防治NEC、败血症和提高早产儿存活率提供充分的理论依据。

1、研究背景：新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）是导致早产儿死亡和远期不良神经系统预后的最严重的胃肠道并发症，其发病机制尚未完全阐明，仍缺乏特异性治疗手段。研究表明，乳铁蛋白（LF）对肠上皮细胞损伤具有保护作用，但迄今为止，有关LF在NEC领域研究报道较少，仍存在较多争议。为此，本研究拟探讨补充外源性LF在NEC中的作用及其机制，为NEC诊治提供新的思路。.2、研究内容：（1）应用早产新生SD大鼠制作NEC动物模型。生后给予人工喂养，bLF干预组在生后即开始给予牛乳铁蛋白（bLF）至造模结束，将动物活杀。分析各组绒毛高度、隐窝深度等。Elisa实验检测肠道组织IL-1β、IL-6、TNF-α。检测肠刷状缘乳糖酶、蔗糖酶、麦芽糖酶活力。通过 Western Blot 实验方法检测MEK、ERK、ELK-1蛋白。通过qRT-PCR 实验方法检测MEK、ERK、ELK-1基因表达。通过免疫组化实验检测MEK、ERK、ELK-1在组织中表达情况。（2）将100μg/ml LPS加入培养的IEC-6细胞，建立NEC体外模型，应用不同浓度LF予处理。通过BrdU标记、MTT、ELISA、流式细胞术、实时荧光定量PCR和Western Blot，研究LF对细胞活性、增值能力及其对炎症因子表达的影响和机制。.3、主要结果：（1）补充bLF可以减轻肠道组织损伤，提高小肠刷状缘蔗糖酶、麦芽糖酶、乳糖酶的活力。（2）补充bLF可以使IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8等炎症因子的表达下降，但部分炎症因子的表达在体内和体外研究存在不一致。（3）bLF可以调节MEK1、ERK2、ELK-1在早产SD大鼠NEC模型中的表达，但调节方向存在不一致。（4）bLF可显著提高IEC-6细胞的细胞活性，通过调节细胞周期S期来促进IEC-6细胞增殖；通过抑制LPS诱导的MAPK磷酸化激活，抑制NF-κB核转录调节TNF-α、IL-6和IL-8的表达.4、结论和意义：（1） LF参与NEC病理过程，补充bLF可以调节炎症因子的表达，抑制炎症反应，对肠道组织具有保护作用。（2）其机制可能与其调节MEK1、ERK2、ELK-1及NF-κB的表达，抑制MAPK通路中 MEK/ERK/Elk-1发生磷酸化有关。探讨不同剂量bLF的效应差异对阐明bLF的作用机制和临床补充LF防治NEC有重要意义。