基因修饰白血病细胞胞外体的生物特性及其抗白血病免疫效应的研究

Leukemic cell-derived exosome (LEX) carries the leukemic antigens from its parental leukemic cells, which can induce anti-leukemic immune response. However, the capacity of LEX to induce anti-leukemic immunity is not optimal. This is possibly due to the low expression of adhesion molecules, MHC-II molecule, and costimulatory molecules in leukemic cells, which causes the low expression of these molecules in LEX. Besides, LEX often carries leukemic cell-derived TGFβ1, which inhibits immune function per se. In this project, we aim at creating a gene-modified leukemic cell line by using lentiviral vectors that permits high expression of adhesion molecule ICAM-1, MHC-II molecule, costimulatory molecules CD40, CD80, CD86, and silencing of TGFβ1 in LEX. Induction of anti-leukemic immune responses by this new LEX will be evaluated in vitro and in leukemic animal model. The final goal of this study is to develop a highly immunogeneic, exosome-based, vaccine for immunotherapy of leukemia.

免疫治疗有望清除白血病患者体内微小残留病，是白血病治疗的重要手段和发展方向。白血病细胞胞外体(Leukemia cell-derived exosome,LEX)负载白血病细胞抗原，可诱导抗白血病免疫效应，但其诱导的抗白血病效率较低，原因在于白血病细胞低表达粘附分子、MHC-II类分子以及共刺激分子，而LEX同样低表达这些重要的分子而不能有效诱导抗白血病免疫效应。另外，LEX本身对免疫反应具有抑制作用，与其负载的TGF-β1有关。本课题拟采用慢病毒载体将ICAM-1,MHC-II,CD40,CD80,CD86转入白血病细胞中，使其释放的LEX高表达这些分子。同时将TGFβ1 siRNA转入白血病细胞中，缄默LEX 的TGF-β1表达。对这基因工程LEX的抗白血病效应，本课题拟在体外以及动物模型对其进行研究。为研制开发出一种具有高度免疫原性的高效的基于LEX的抗白血病疫苗提供理论和实验依据。

背景和目的：LEX负载白血病抗原，可诱导抗白血病免疫，但效率低，与其低表达MHC-II及共刺激分子有关。另外，LEX对免疫细胞有一定的抑制作用，与其负载的TGF-beta1有关。本项目采用基因工程将CD80,CD86转入白血病细胞中，使其释放高表达共刺激分子LEX。将TGF-β1 siRNA转入白血病细胞中，缄默LEX 的TGF-β1表达。对基因工程LEX的抗白血病效应进行研究。方法：应用siTGF-TGF-beta1RNA慢病毒转染白血病细胞，获得低表达TGF-β1 LEX（LEXTGF-β1si)；应用负载CD80,CD86基因慢病毒载体转染白血病细胞，获得高表达共刺激分子LEX。应用体外及动物模型进行研究。结果： LEXTGF-β1si下调DC的TGF-β1，促进DC成熟及IL-12P因子释放，增强DC细胞的抗原递呈功能。LEXTGF-β1si显著地促进CD4+T细胞增殖，促进其Th1 因子分泌。LEXTGF-β1si免疫小鼠能够诱导较普通LEX更强的抗白血病CTL效应。实验组小鼠成瘤率明显低于对照组，小鼠中位OS明显高于对照组。同时低表达LEXTGF-β1si靶向结合的DC（DCLEX-TGF-β1si）能够诱导更强的抗肿瘤效应。DCLEX-TGF-β1si能显著地促进 CD4+ T细胞增殖并促进Th1因子的释放，诱导更强的抗原特异性的抗白血病CTL免疫。在动物模型中DCLEX-TGF-β1si 能诱导更强的抗白血病免疫保护，实验组小鼠成瘤率低，OS明显长于对照组。同时荷瘤小鼠的生存期也明显长于对照组。高表达共刺激分子的LEX（LEXCD80, LEXCD86 和LEXCD8086）能显著提高DC的CD80, CD86及CD11C表达，同时也明显地促进其TNF-alpha, IFN-gama 以及 IL-12的分泌。LEXCD80, LEXCD86 和LEXCD8086 能显著地促进 CD4+ T细胞增殖并能促进Th1 因子的释放。在动物模型中，LEXCD80, LEXCD86 和LEXCD8086 能显著地抑制肿瘤的生长，尤其是LEXCD8086。而LEXCD80, LEXCD86 和LEXCD8086靶向结合DC能够诱导更强的抗肿瘤效应，在动物模型中可起到治疗肿瘤的作用。结论：应用基因工程缄默LEX免疫抑制因子及高表达共刺激分子可提高LEX的抗肿瘤免疫。