面包酵母海藻糖代谢机制与耐冷冻机理的研究

胞内海藻糖含量是面包酵母具备耐冷冻性的重要因素，而冷冻面团预发酵过程中，海藻糖酶分解系统的迅速启动是胞内海藻糖急剧下降的主要原因。前期实验中我们推测面包酵母中可能存在另一海藻糖分解代谢途径。本课题拟将建立一种高效无痕基因敲除系统，构建工业面包酵母的各种海藻糖酶缺失突变株，对突变株的海藻糖分解进行动力学分析，结合胞外海藻糖的利用情况以及葡萄糖等诱导作用的研究确证推测的海藻糖代谢途径，完善胞内海藻糖代谢机制；在此基础上选育优良的耐冷冻面包酵母菌种。本研究中高效无痕基因敲除系统的建立，使选育的菌株不存在安全隐患，可用作工业生产菌种，同时对推动酵母的分子遗传研究具有重要作用；海藻糖代谢途径的确证，对耐冷冻面包酵母菌种的选育和冷冻面团生产工艺的发展和推广具有重要的指导意义；研究结果将解决冷冻面团制作过程中的技术障碍和质量缺陷，提高我国烘焙食品工业的生产技术水平，对促进我国酵母工业的发展具有重要意义。

胞内海藻糖含量是面包酵母具备耐冷冻性的重要因素，而冷冻面团预发酵过程中，海藻糖酶分解系统的迅速启动是胞内海藻糖急剧下降的主要原因。本研究对中性海藻糖酶和酸性海藻糖酶酶活性测定系统进行了重建和优化，通过构建三种海藻糖酶基因单缺、双缺和三缺突变株，研究海藻糖酶基因缺失对面包酵母胞内海藻糖分解的影响，确定三种海藻糖酶特别是Nth2p、Ath1p的作用机制。同时，通过分析外加海藻糖、海藻糖合成代谢、海藻糖分解代谢对己糖激酶活性的影响，确定海藻酶代谢对糖酵解途径特别是己糖激酶的调控机制，进一步确定海藻糖酶在面包酵母中的功能。利用两步基因置换法成功建立了酿酒酵母基因无痕敲除系统，通过该系统构建的基因敲除突变株不会引入任何酿酒酵母以外的其他DNA序列，菌株不存在安全隐患，可以直接用于工业生产。在此基础上，通过构建海藻糖酶基因缺失同时过表达TPS1基因突变株，抑制海藻糖分解速度的同时提高海藻糖的合成能力，使面包酵母胞内海藻糖含量始终处于较高水平，提高了冷冻面团中面包酵母的耐冷冻能力。本研究为探索面包酵母海藻糖酶协同作用机制提供了理论依据和实践基础，对探索面包酵母海藻糖分解代谢机制和耐冷冻机制以及耐冷冻面包酵母菌种选育具有重要的指导意义。