番茄果实选择性剪接事件的鉴定及其调控果实发育的机理研究

The prevalent alternative splicing of pre-mRNA plays an important role in regulation of gene expression in multicellular organisms through increasing transcriptome and proteome complexity. Tomato, as a important vegetable crop and a research model for fruit development study, is also excellent system for studying alternative splicing because its fruits undergo active cell division and differentiation as well as metabolism during fruit development and ripening. However, how the alternative splicing is regulated during tomato fruit development and ripening is poorly understood. In this proposal, we intend to perform a detailed analysis of the alternative splicing events during tomato fruit development and ripening by high throughput mRNA sequencing. We are expected to obtain the landscape of alternative splicing events in the fruits, and identify genes showing differential splicing during fruit development and ripening. Moreover, we also propose to dissect the roles of alternative splicing in controlling fruit size by functional analysis of the zinc finger protein encoding gene SlPZF1 (Solanum lycopersicum Pericarp Specific Zinc Finger Protein1) mainly expressed in fruit pericarps, which underwent alternative splicing during early fruit development. The new findings obtained from this project may provide new strategies for genetic improvement of yield and quality traits in tomato and other crops.

信使RNA前体（pre-mRNA）的选择性剪接是真核生物基因表达调控的一个重要机制，它通过增加转录组和蛋白质组的复杂性，参与调控众多植物生长发育过程中的基因表达。番茄作为重要的蔬菜作物和研究果实发育的模式植物，其果实发育过程中先后经历了旺盛的细胞分裂、分化和活跃的次生物质代谢活动，因此番茄果实是研究选择性剪接的良好系统，但目前这方面的研究很少。项目组拟在前期工作的基础上，通过转录组测序系统研究番茄果实发育和成熟过程中的选择性剪接事件，获得番茄果实的选择性剪接“全景图”和果实特异的选择性剪接基因集。同时，通过对果皮特异表达的锌指蛋白编码基因SlPZF1(Solanum lycopersicum Pericarp Specific Zinc Finger Protein1) 的功能研究来阐明选择性剪接在控制番茄果实大小中的重要作用，为遗传改良番茄等农作物的产量和品质等农艺性状提供理论和新途径。

Pre-mRNA的选择性剪接是是真核生物基因表达调控的重要途径之一。植物在生长发育、响应生物和非生物逆境过程中有大量的基因发生选择性剪接事件。果实生长发育是植物重要的生命过程，基因表达变化非常活跃，但选择性剪接缺乏系统性的分析。为了解选择性剪接在番茄果实生长发育过程中的作用，明确不同果实生长发育阶段发生选择性剪接的总体情况，包括发生选择性剪接的基因、剪接方式或类别，以及选择性剪接所产生的剪接变体的表达特征，项目组构建了番茄品种Heinz1706的9个果实发育时期共计27个果实RNA-seq文库。通过RNA-seq测序，获得了390M多个长度为100bp的测序片段。从这些数据中检测到来自24459个基因的70052个转录本在果实中表达，其中有 14629个多外显子基因发生了选择性剪接，占表达多外显子基因的70.61%，其中有73.34%的蛋白编码基因发生了选择性剪接。通过比较不同发育阶段的选择性剪接事件，共鉴定608个基因发生差异性的选择性剪接。通过比较醋栗番茄LA1589和栽培番茄Heinz1706的转录组，发现驯化改变了选择性剪接，推测与栽培番茄果实变大、成熟过程中糖酸等代谢产物积累发生改变有关。通过对不同种植环境的植株进行转录组分析，项目研究还鉴定到环境响应的选择性剪接事件。本项目鉴定到的选择性剪接事件，不仅丰富了我们对果实生长发育过程中基因发生选择性剪接事件的了解，更为下一步研究选择性剪接调控果实生长和成熟过程提供了丰富的遗传信息。. 项目组还以锌指蛋白编码基因SlPZF1为例，通过过量表达、RNAi和CRISPR等转基因方法，并结合果实表型、细胞学、基因表达分析等，研究了SlPZF1及其剪接变体SlPZF1-AS控制番茄果实大小的作用，并利用酵母双杂交、BiFC等生化技术鉴定和验证了14个SlPZF1互作蛋白。研究结果发现SlPZF1参与胞内复制介导的细胞大小调控，剪接变体SlPZF1-AS具有类似的功能。SlPZF1的功能研究揭示了一个选择性剪接事件在调控果实生长发育过程中的分子机制。