玉米奥帕克-16（o16）突变基因的分离克隆与鉴定

玉米高赖氨酸育种是品质育种重要研究领域，主要以o2突变为种质。新种质缺乏是其发展瓶颈。而且，o2玉米籽粒赖氨酸（Lys）含量仅为0.4%左右，不能满足人畜禽需求，为其提供了发展空间。用自育新突变奥帕克-16（o16）与o2突变基因聚合的分子标记辅助选择，表明可提高Lys含量。但o16基因的序列、结构及其对胚乳质地和Lys含量的调控等科学问题则未知。本研究拟以o16和o2突变体及其近等基因系以及普通玉米为试材，用Mu Illumina法结合分子生物信息学分析分离克隆o16基因，用基因专化PCR、遗传作图、RT-PCR等进行共分离和表达鉴定，用RT-PCR扫描技术获取全长cDNA，用RNAi技术进行功能鉴定分析，以期认识o16基因的核苷酸序列、基因结构及其对玉米籽粒胚乳质地和Lys含量的调控。这对o16突变调控玉米籽粒胚乳质地和Lys含量的机理研究和寻找高Lys分子育种新方法有科学和实践意义。

普通玉米籽粒缺乏赖氨酸，营养价值较低；而高赖氨酸玉米籽粒赖氨酸含量高，营养价值较高。玉米奥帕克-16（opaque-16，o16）突变是Mu转座子插入诱导的突变，籽粒赖氨酸含量高。将它与opaque-2（o2）、waxy（wx）基因聚合后，可较大幅度提高玉米籽粒赖氨酸含量。本研究以o16突变、F2群体和近等基因系（NILs）等为材料，进行了NILs的继续选育、o16突变系的Mu Illumina测序、F2群体简化基因组测序（SLAF-seq）、o16突变NIL的Mu Illumina测序、候选基因专化PCR、候选基因RT-qPCR以及o2和o16突变NIL非标记定量蛋白质组（LC-MS/MS-based labelfree quantitative proteomics）等研究。取得如下主要结果：（1）在具有不透明籽粒表型的NILs中，o16系的赖氨酸含量与o2系的相当或高于o2系的。（2）QCL3021-5和QCL3024-4两个o16突变系共有Mu插入基因数137个，主要分布在Chr1、Chr4、Chr2、Chr3和Chr9上。（3）从SLAF标签中，筛选出6个候选区域，涉及174个基因，其中144个在Chr5上，30个在Chr2上。（4）Mu在4个NILs中插入的独有基因数和交叠基因数共有64个，分布在玉米的十条染色体上，以Chr8上分布最多。（5）上述3次测序对候选基因的分析结果，基本上没有相同的。（6）对NILs中的27个Mu插入候选基因（除独有基因外）进行RT-qPCR，结果表明11个基因的表达与赖氨酸含量显著相关，其中4个基因位于Chr8上。（7）非标记定量蛋白质组的结果表明，在o2系和o16系间有16组蛋白有显著性差异；o2系中有76组蛋白在o16系中没有，o16系中有51组蛋白在o2系中没有。上述结果，对o16突变特定候选基因的筛选以及o16突变及其高赖氨酸形成的机理研究奠定了基础。