在DDR反应中ERK激酶调节ATR活化的分子机制研究

DNA damage response is the critical surveillance mechanism that maintains genomeDNA damage response (DDR) is the critical surveillance mechanism that maintains genome integrity and ensures the accurate transmission of genetic information between generations of eukaryotic cells. DDR is the driving force of tumor suppression mechanism in humans. This process is initiated and coordinated by two apical kinases, ataxia-telangiectasia mutated (ATM) and ATR(ATM- and Rad3-related). We have recently demonstrated that ERK1 and ERK2 kinases play a critical role in ATM activation and ATR recruitment to DNA lesions. ERK kinases have been shown to interact with ATR according to the result of coimmunoprecipitation.(COIP). This interaction may contribute to ERK-facilitated ATR recruitment to DNA lesioins. However, how ERK interacts with ATR and regulates DDR remains largely unclear. Our aim in this research is to determine the structural elements or domains of ERK, which are responsible for ATR association, and to research the impact of these domains on ERK-facilitted acivation of ATR signalling using a variety of methods, including siRNA interference and CO-IP.This proposal is to investigate the mechanisms whereby the ERK kinases regulate DNA damage-induced ATR activation. This research may pave the way to deveop novel anti-cancer therapy.

DNA损伤反应(DDR)是真核细胞维护遗传信息传递的准确性和完整性的重要调控机制，是人体抵御恶性肿瘤的重要防御机制。当DDR发生时，ATM、ATR等蛋白激酶激活并使多种DNA损伤检控蛋白磷酸化从而启动一系列信号传递通路。本课题组最近研究发现ERK激酶在ATM与ATR反应的DNA损伤通路中起到重要的调节作用，免疫共沉淀结果发现ERK激酶与ATR蛋白存在结合区域，但具体的调控机制与结合位点尚未明确。课题组拟利用siRNA干扰与免疫共沉淀等分子生物学技术确定ERK激酶与ATR蛋白具体结合区域，以及结合区域对ATR信号的调控机制。进而明确DDR过程中ERK激酶对ATR的调控机制，为抗肿瘤药物作用机理寻找新靶点提供理论依据。

项目背景：机体在长期进化中发展了一整套DNA损伤反应(DDR)保证基因组的完整性，其中最重要的就是通过激活检验点以阻止细胞周期进程并修复损伤的DNA。细胞外信号调节激酶（ERK）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路是经典的细胞信号转导通路，具有调节细胞增殖、分化、凋亡等多种功能。当DDR 发生时，ATM、ATR 等蛋白激酶激活并使多种DNA 损伤检控蛋白磷酸化从而启动一系列信号传递通路。研究内容：课题组利用siRNA 干扰与免疫共沉淀等分子生物学技术确定ERK 激酶与ATR蛋白具体结合区域，以及结合区域对ATR 信号的调控机制。进而明确DDR 过程中ERK 激酶对ATR 的调控机制。研究结果：1、ERK1和ERK2激酶在ATR激活和DNA损伤引发的ATR募集过程中发挥了关键作用，证明ERK激酶通过减弱DNA-PK激酶的活化，减少NHEJ（non-homologous end joining）介导的DNA双链的修复。2、免疫共沉淀结果证明ERK激酶与ATR-ATRIP复合体结合。3、ERK激酶与ATR/ATRIP蛋白相互作用区域增强ATR信号。4、ATR/ATRIP与ERK激酶结合区域对增强ATR信号。5、基因芯片分析发现68个差异表达基因。重点研究了Bmi1基因与PTEN基因在DDR中的作用机制。6、Bmi1蛋白与ERK1/2激酶结合，通过减少ATM活化，减弱依托皂甙介导的G2/M细胞周期阻滞。7、PTEN通过活化ATM通路，增强依托皂甙介导的细胞周期阻滞。 科学意义：DNA损伤反应监测基因组的完整性,激活细胞周期检验点，停止细胞进程,修复损伤的DNA。ATM 与ATR蛋白参与和协调这个过程。本课题组前期研究发现ERK激酶在ATM与ATR反应的DNA损伤通路中起到重要的调节作用，免疫共沉淀结果发现ERK激酶与ATR蛋白存在结合区域，但具体的调控机制与结合位点尚未明确。虽然化疗药物通常能诱导DNA损伤，ERK途径的小分子抑制剂也被积极探索用于癌症治疗。联合使用基因毒性药物和ERK激酶抑制剂用于治疗癌症的想法还需要谨慎考虑。因为ERK促进DNA损伤反应，可以设想上述联合疗法可能引起DNA损伤的积累。这将增强化疗药物的遗传毒性效应的敏感性。然而，另一方面，抑制ERK激酶的活性可能会使检验点的激活减弱因此使有DNA损伤的细胞增殖。这可能会导致突变并形成二级癌症。