RBM28核仁-核质转位抑制p53转录活性的分子机制和意义

By integrating tumor proteomics, transcriptomic and five-year survival data, we identified RBM28 that showed elevated protein level in multiple tumor tissues, and its mRNA level was correlated with poor prognostics. Our data showed that knockout of RBM28 significantly inhibited proliferation and colony formation in multiple cancer cell lines. RBM28 nucleolus-nucleoplasm translocation was probably regulated by phosphorylation. In nucleoplasm, RBM28 inhibited p53 transcription activity by direct binding. In this proposal, we will further explore the following aspects: how RBM28 inhibited p53 transcription activity; how RBM28 was translocation from nucleolus to the nucleoplasm and how the translocation linked the nucleolar protein RBM28 with p53 transcription activity; whether targeting the RBM28 translocation or blocking the interaction between RBM28 and p53 could promote tumor inhibition and sensitize cancer cells to ADR, CPT chemotherapy. This project reveals a novel function of RBM28, links the nucleolar stress response with DNA damage and p53, and identifies the kinase and/or nucleolus-nucleoplasm shuttling protein that regulates the translocation process. Targeting the RBM28-kinase/shuttle protein-p53 axis probably can reactivate p53 in cancer cells, and provides new therapeutic strategy for cancer treatment.

通过对肿瘤蛋白组、转录组数据以及预后信息整合分析，我们发现RNA结合蛋白RBM28在多种肿瘤组织中蛋白水平显著升高，而且其mRNA水平与病人预后呈负相关。预实验显示：敲除RBM28抑制肿瘤细胞增殖和克隆形成；RBM28可能通过苏氨酸磷酸化修饰调控其核仁-核质转位，在核质中结合p53并抑制其转录活性。本项目拟研究：进一步明确RBM28抑制p53转录活性；RBM28核仁-核质转位的机制及其对p53转录活性的影响；靶向RBM28核仁-核质转位或阻断RBM28与p53相互作用能否抑制肿瘤，增加肿瘤化疗敏感性。本项目的完成将揭示RNA结合蛋白RBM28新功能，并将核仁应激与DNA损伤及p53功能联系起来，阐明RBM28通过磷酸化修饰/穿梭蛋白调控转位的机制。靶向该通路可能激活p53的肿瘤抑制作用，为肿瘤治疗提供一种新的策略。

综合DepMap细胞系数据库、TCGA转录组数据库、CPTAC定量蛋白质组学数据库和病人5年生存期信息，我们发现RBM28是肿瘤细胞系生长依赖关键基因，同时在多种肿瘤组织中蛋白水平显著升高，与病人的预后呈负相关，提示RBM28可能是一个潜在的肿瘤治疗分子靶点。然而RBM28在肿瘤中发挥的功能目前尚无报道，所以我们对RBM28的功能进行深入研究。.RNA结合蛋白RBM28定位于细胞核核仁中，是snRNP复合物相关蛋白。目前对其功能了解较少。首先我们通过RNA-seq发现敲除RBM28后p53通路活性显著增强，qPCR也验证了这一结果。进一步通过ChIP-qPCR我们检测到敲除RBM28后p53在p21启动子上的丰度增加，同时p21的转录水平和蛋白水平也增加，提示RBM28敲除后p53的转录活性增强。我们观察到RBM28虽然是核仁蛋白，但在核质中也有分布，可能存在在核质中的RBM28直接与p53相互作用的情况，进而，我们通过内源IP明确了二者的直接相互作用。通过构建多个蛋白截短体进行共转实验，我们最终确定RBM28通过1-95,96-258和468-759三个区域与p53的100-300区域相互作用。进一步，我们深入研究RBM28核仁核质转位的机制。我们发现在多种化疗药物能增强RBM28核仁-核质转位，其中ADR的促进能力最强。考虑到化疗药物导致细胞DNA损伤，其中Chk1/Chk2是此过程中最先被激活并且最重要的损伤修复激酶之一。确实，Chk1/Chk2抑制剂能显著抑制ADR诱导的RBM28核仁-核质转位，共同敲低Chk1/Chk2也观察到相似的抑制效应，提示Chk1/Chk2对RBM28核仁-核质转位有重要调控作用。最后，我们鉴定到，在ADR处理情况下，Chk1/Chk2能通过磷酸化RBM28 S122，促进其发生核仁-核质转位。.本研究的科学意义在于鉴定了一个新的肿瘤治疗分子靶点RNA结合蛋白RBM28，揭示其新功能，即作为核仁压力感应分子，发生核仁-核质转位，将外部刺激转化为p53的应答。基于本研究揭示的机制，其表达量可作为预测野生型p53肿瘤病人对Chk1/Chk2抑制剂敏感性的潜在分子标志物。