NR3C1基因突变在成人急性淋巴细胞白血病耐药与复发中的作用与机制研究

Drug-resistance and disease relapse are the leading causes of death in adult patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL). Several adverse genetic alterations-including rearrangement of the myeloid-lymphoid or mixed-lineage leukemia genes and Philadelphia (Ph) chromosome - are responsible for treatment failure and relapse in ALL. However, many Ph chromosome-negative (Ph?) ALL patients with normal karyotype and who lack documented risk factors also experience relapse. The pathologic determinants and prognostic markers in these cases remain poorly understood. In our previous study, we performed longitudinal whole-exome sequencing analysis in matched samples from adult patients with Philadelphia chromosome-negative (Ph?) B-cell acute lymphoblastic leukemia (Ph? B-ALL) from diagnosis to relapse after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). We found that the NR3C1 gene, encoding a transcription factor/glucocorticoid receptor, was selectively mutated in relapsed samples from two cases and is therefore a putative relapse-specific mutation in adult ALL. Furthermore, mutations within the NR3C1 genes occurred exclusively in sites that are highly conserved across species and were distributed in glucocorticoid receptor functional domains, which would be predicted to result in the loss of protein function. Based on our previous study findings, in the present study, we attempt to elucidate the role and mechanisms of NR3C1 gene mutations in drug-resistance and relapse of ALL by ex vivo cell studies, transplantation animal model studies and gene mutation knock-in mouse model studies. Our study may provide valuable information to research of the mechanisms of leukemia relapse and drug-resistance and improve the survival of adult ALL patients.

难治、复发是影响急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL）患者获得长期生存的首要障碍，发现新的复发相关基因突变不仅有助于深入理解ALL复发的发生机制，还有助于探索有效的干预治疗靶点。本课题组在前期研究中，首次利用全基因组外显子测序技术筛选出成人ALL发生异基因造血干细胞移植后复发时，复发白血病细胞特异性获得糖皮质激素受体编码基因—NR3C1基因突变，且突变位点位于蛋白的糖皮质激素受体功能区域。本项目拟在前期研究基础上进一步围绕发现的NR3C1基因第2号外显子两个突变位点（exon2:c.431_431 delinsAG；exon2: c.640C>T），首次通过临床研究、体外细胞实验和基因定点突变动物模型研究明确NR3C1基因突变对糖皮质激素受体蛋白功能、糖皮质激素促白血病细胞凋亡信号通路的影响，及诱导ALL耐药和复发的分子机制。

急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL）是成人恶性肿瘤中最具挑战的疾病之一， 难治、复发是影响ALL患者获得长期生存的首要障碍。发现新的复发相关基因突变不仅有助于深入理解ALL复发的发生机制，还有助于探索有效的干预治疗靶点。本项目组在前期研究中，首次利用全基因组外显子测序技术筛选出成人ALL发生异基因造血干细胞移植后复发时，复发白血病细胞特异性获得糖皮质激素受体编码基因—NR3C1基因突变，且突变位点位于蛋白的糖皮质激素受体功能区域，突变类型均导致蛋白合成提前终止，导致NR3C1蛋白单倍型表达不足。本项目在前期研究基础上进一步围绕NR3C1基因单倍型表达不足致ALL耐药的机制开展研究，经过4年的具体实施，基本完成预定工作计划，并取得一些重要进展：（1）明确ALL细胞内源性NR3C1表达与细胞对地塞米松的敏感性呈正相关；（2）通过慢病毒转染使ALL耐药细胞（Reh、Jurkat）过表达NR3C1蛋白后，可增强地塞米松诱导的ALL细胞凋亡、抑制细胞增殖，逆转ALL耐药细胞对地塞米松的耐药性；（3）对地塞米松敏感的ALL细胞（CCRF-CEM、6T-CEM、Nalm6细胞），通过CRISPR/CAS9技术靶向敲除NR3C1基因后，ALL细胞获得对地塞米松的耐药性；（4）RNA-seq技术检测发现NR3C1蛋白主要参与细胞凋亡、p53途径、细胞周期等通路的调节。NR3C1蛋白通过激活GSK3β信号通路、促进促凋亡蛋白（Bad、Bim）表达、抑制抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-XL）表达，从而参与ALL细胞对糖皮质激素耐药；（5）携带NR3C1基因突变的ALL细胞对地塞米松耐药，但Bcl-2抑制剂可以逆转其耐药性，提示在携带NR3C1基因突变的ALL患者治疗中联合使用Bcl-2抑制剂可能具有潜在的应用前景。本项目研究成果在《OncoImmunology》 （IF 5.503）、《Bone Marrow Transplant》（IF: 4.497）等SCI收录杂志发表第一作者和通讯作者（含共同）论文5篇，在2018年美国血液学年会壁报交流、在2018年全国血液学年会大会口头报告。培养2名硕士研究生（其中1名以项目研究内容为学位论文于2018年顺利毕业）。负责人2018年评为浙江省“151人才工程”第二层次培养人才。