环二鸟苷酸对糖尿病小鼠的铜绿假单胞菌生物膜的调节及机制的研究

Our previous works have demonstrated that during intraperitoneal implant Pseudomonas aeruginosa(PA) infection，the biofilm(Bf) formation and the infection severity were regulated by the quorum sensing system. Based on our previous works, we will construct different strains ( with high/low second messenger c-di-GMP levels ) with green fluorescent protein by molecular cloning methods, establish various models (static、 flowing and daibetic mice models), and apply different techniques (histchemistry、immunflurescence histochemistry、fluorescence in situ hybridisation and confocal laserscanning microscopy) to these models, to 1) explore the role and mechanism of c-di-GMP signal pathway in PA-Bf formation、 histological analysis、viable bacterial count、 the expression of IL-Iαand TNF-αof the infected wound surface of untreated diabetic mice; 2) elucidate the role and mechanism of c-di-GMP signal pathway during the insulin treatment in PA motility assays、Bf formation and antibiotic tolerance； 3) investigate the effects of insulin treatment on the histological analysis、viable bacterial count、 the expression of IL-1αand TNF-α of the infected wound surface; 4) further evaluate the influences of insulin treatment on PA-Bf in daibetic mice through the c-di-GMP signal pathway.

我们以前的工作发现，小鼠体内移植物的铜绿假单胞菌（PA）感染过程中,生物膜（Bf）形成及感染的程度受群体感应传导通路的调节。本项目在此基础上，运用分子克隆技术构建含绿色荧光蛋白的高表达或低表达环二鸟苷酸（c-di-GMP）的突变菌株和临床菌株，建立静止模型、持续流体模型和糖尿病鼠模型，使用组织化学、免疫荧光组化、荧光原位杂交，共聚焦激光显微镜等技术，（1）探讨c-di-GMP传导通路在未治疗的糖尿病小鼠创面形成PA-Bf过程中的调控作用，以及其对感染创面的组织形态、活菌数量、抗生素耐受性、IL-Iα和TNF-α的表达的影响；（2）探讨胰岛素干预PA运动能力、抗生素耐受性的过程中,c-di-GMP的调控作用；（3）探讨胰岛素治疗对创面形态、活菌数量、IL-Iα等指标的影响；（4）进一步在c-di-GMP通路层面上明确糖尿鼠模型病中胰岛素对PA-Bf的影响。

铜绿假单胞菌（PA）是糖尿病（DM）足感染的重要病原体，能够形成生物被膜(Bf),导致慢性感染。既往DM鼠研究发现，和未形成Bf的创面感染相比，形成Bf的创面感染愈合需要更长时间。第一个研究中，我们首先探讨INS对三种菌株（野生型PAO1，C-di-GMP 低表达 PAO1/Plac-yhjH和 C-di-GMP 过表达 PAO1ΔwspF） 运动能力的影响，我们发现INS能抑制 PAO1 和PAO1/Plac-yhjH 的泳动、群集能力。我们又发现INS能促进PAO1、PAO1/Plac-yhjH、 PAO1ΔwspF形成Bf，INS能明显促进 PAO1/PcdrA-gfp和PAO1/Plac-yhjH/PcdrA-gfp的GFP表达。因此INS能够通过胞内 c-di-GMP 通路促进 PAO1 和 PAO1/Plac-yhjH形成Bf。动物模型中，我们使用上述三种PA菌株感染创面，对比非DM组、DM组、DM+INS组的差异。我们发现PAO1/Plac-yhjH 感染组创面愈合最快；DM+INS组最慢。PAO1、PAO1△wspF组有类似结果。我们使用PNA-FISH、ConA-FITC 染色证实创面感染组织中形成PA-Bf，其中PAO1△wspF 形成Bf能力最强。与DM组、非DM组比较，DM+INS组观察到更多的 PA-Bf。综上，本研究结果提示INS促进C-di-GM的合成，进而促进 PA-Bf 的形成。第二个研究中，为分析DM是否会对 PA 演化过程造成影响，我们选择了合并呼吸机相关性肺炎（VAP）的（非）DM患者的 菌株进行测序+生物信息学分析。系统演化分析结果提示菌株间基因组非常接近，组成一个新型单源群。序列比对结果提示 PA_D1 基因组中存在数个特异区域， 同时存在着许多与特异区域密切相关的基因组岛，提示PA_D1 通过水平基因转移获得这些基因组区域，此外菌株含有位于基因组岛内的相同抗生素耐药基因，提示水平基因转移参与耐药基因产生过程。 最后，我们用小鼠腹腔感染模型验证了PA 演化过程促使后期分离菌株较早期分离菌株的毒力有所减弱，有助于在宿主体内继续存活，即“适者生存”。综上，对PA的基因组研究有助于了解PA演化过程，有助于开发慢性感染新模型，阐明PA传播网络，为制定临床干预策略指明了方向。