VEGF和SDF-1双基因共表达诱导神经前体细胞定向迁移治疗脑梗死的实验研究

神经血管再生是脑梗死神经功能恢复的必要前提。申请者的前期研究证实，VEGF表达不仅可以促进脑缺血半暗带（靶区）的血管新生，而且对神经再生与迁移也有直接的促进作用；但是能够迁移到靶区的新生神经前体细胞（NPCs）数量较少，仅占NPCs总数的1%左右，是制约神经功能进一步改善的瓶颈。基质细胞衍生因子(SDF-1)是一种趋化因子，兼有促进血管新生和趋化NPCs归巢的功能。本研究拟对以前的基因治疗策略进行优化，构建含有VEGF和SDF-1双基因表达盒的腺病毒载体，用于脑缺血的实验治疗，使大鼠脑内同时表达VEGF和SDF-1，发挥其协同治疗作用，既能够促进血管新生和神经再生，又能够趋化更多的NPCs定向迁移到靶区，以促进神经功能更好恢复。拟对靶区新生神经血管巢（Niche）的分子结构及信号途径进行深入研究，揭示VEGF和SDF-1在脑梗死神经血管再生中的作用和机制，为脑缺血的基因治疗提供新的思路。

研究背景：血管内皮生长因子165（VEGF165）基因表达可以改善脑缺血半暗带的血流灌注，促进神经前体细胞（NPCs）增殖与迁移。但是，能够存活并迁移至缺血区域的NPCs数量较少，成为制约神经功能进一步改善的瓶颈。基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)具有趋化NPCs向缺血脑组织趋化归巢的作用。两者协同作用于缺血的脑组织，可能发挥协同治疗作用。.研究方法：采用DNA重组技术，构建VEGF165和SDF-1双基因共表达的腺病毒载体；以线栓法构建大鼠短暂性脑缺血模型（MCAO），采用立体定向脑室内注射的方法，将Ad5-VEGF165-IRES-SDF-1注入MCAO大鼠的侧脑室，用于脑缺血的基因治疗。以RT-PCR、Western Blot及免疫荧光标记检测目的基因在缺血的大鼠脑组织中的表达，通过神经功能评分（NSS）检查大鼠神经功能的改善情况，以免疫荧光共聚焦检测及高场强MRI检测大鼠脑的梗死体积及血流灌注情况，通过BDA和BrdU标记法，检测转基因对于大鼠神经再生和轴突生长的作用。本研究一共分为4部分。.1．VEGF165和SDF-1双基因共表达腺病毒载体的构建.2．Ad5-VEGF165-IRES-SDF-1介导VEGF165和SDF-1基因在大鼠缺血脑组织中的表达.3．VEGF/SDF-1双基因促进大鼠缺血脑组织血管新生及血流改善.4．VEGF及SDF-1对大鼠缺血脑组织神经再生及轴突生长的影响.研究结果：.1．成功构建了VEGF165和SDF-1双基因共表达的腺病毒载体Ad5-VEGF165-IRES-SDF-1。.2．Ad5-VEGF165-IRES-SDF-1可以介导VEGF165和SDF-1基因在大鼠缺血脑组织中的表达。.3．VEGF165和SDF-1基因表达可以有效减小大鼠脑梗死的体积，并改善其神经功能，BrdU和DCX荧光双重标记显示可以显著增加神经前体细胞NPCs的再生和迁移数量。可以显著增加CD34标记的血管新生的数量，有效改善了脑缺血半暗带的供血。MRI多检测指标（CBF、CBV、MTT）显示基因治疗可以明显改善大鼠脑的供血，增加其脑血容量。.结论：.我们的研究进一步证实，VEGF165和SDF-1基因联合治疗可以有效促进神经前体细胞的再生和迁移，新生血管生成、脑血流的改善，这为改善神经功能提供了物质基础。